[發(fā)明專利]利用聚羥基丁酸作為胞內(nèi)碳庫提高子囊霉素產(chǎn)量的方法

有效

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• 申請日: 2020-11-05
• 公開（公告）號: CN112301072B
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發(fā)明（設計）人: 聞建平;王盼;銀瑩
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/76
• 分類號: C12N15/76;C12R1/55;C12P17/18
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 王麗

1.一種利用聚羥基丁酸作為胞內(nèi)碳庫提高子囊霉素產(chǎn)量的方法；其特征是，利用基因工程技術將來自羅爾斯通氏菌的PHB合成基因phaC和來自吸水鏈霉菌子囊亞種的PHB分解基因fkbU串聯(lián)整合到吸水鏈霉菌子囊亞種ATCC14891菌株基因組上，利用聚羥基丁酸作為胞內(nèi)碳庫提高FK520產(chǎn)量的方法；所述的phaC的已知核苷酸序列SEQ ID NO:1；所述的fkbU基因的已知核苷酸序列SEQ ID NO:2。

2.如權利要求1所述的方法，其特征是，包括步驟如下：

1)根據(jù)PHB合成基因phaC的已知核苷酸序列SEQ ID NO:1，設計PCR引物，以Ralstoniaeutropha H16基因組為模板，擴增PHB合成基因phaC；

2)根據(jù)PHB分解基因fkbU基因的已知核苷酸序列SEQ ID NO:2設計PCR引物，以Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus ATCC14891基因組為模板，擴增PHB分解基因fkbU；

3)將PHB合成基因phaC與分解基因fkbU通過融合PCR串聯(lián)成一整個基因片段，其核苷酸序列為SEQ ID NO:3；

4)將3)中的融合片段連入表達載體中pIB139，獲得phaC與fkbU雙基因連接在載體pIB139上的重組載體pIBOPF；

5)將4)中構建好的重組載體pIBOPF通過結合轉移的方法整合到Streptomyceshygroscopicus var.ascomyceticus ATCC14891基因組上，構建phaC與fkbU雙基因整合在ATCC14891基因組上的基因工程菌株；

6)培養(yǎng)5)中構建好的基因工程菌株，發(fā)酵生產(chǎn)FK520。

3.如權利要求2所述的方法，其特征是，所述步驟1)中設計PCR引物如下：

OphaC-fkbU-F1:GGAATTCCATATGGCGACCGGCAAAGGCGCGGCAG

4.如權利要求2所述的方法，其特征是，所述步驟2)中設計PCR引物如下：

5.如權利要求2所述的方法，其特征是，所述步驟4)將融合PCR獲得的phaC和fkbU兩基因融合片段進行切膠回收后，用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XbaⅠ進行酶切反應，同時將質(zhì)粒pIB139也進行NdeⅠ和XbaⅠ雙酶切反應，用T4連接酶將含酶切末端的融合片段與含相同酶切末端的表達質(zhì)粒pIB139中過夜進行酶連反應。

6.如權利要求2所述的方法，其特征是，所述步驟5)將重組載體pIBOP轉化進Escherichia coli ET12567作為結合轉移的供體菌株，S.hygroscopicusvar.ascomyceticus ATCC14891作為結合轉移的受體菌株。

7.如權利要求2所述的方法，其特征是，所述步驟6)中的培養(yǎng)方法為：將本發(fā)明構建的基因工程菌株在MS固體培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)18-25天，直至孢子變黑即成功培養(yǎng)成熟的基因工程菌株及其孢子。