[發明專利]熒光原位雜交探針及其制備方法與應用

在審

• 申請號: 202011218809.3
• 申請日: 2020-11-04
• 公開（公告）號: CN112266947A
• 公開（公告）日: 2021-01-26
• 發明（設計）人: 陳靜
• 申請（專利權）人: 南偲生物科技（南京）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6841;C12N15/11
• 代理公司: 北京酷愛智慧知識產權代理有限公司 11514
• 代理人: 王靜

本發明涉及一種熒光原位雜交探針及其制備方法與應用，制備方法包括步驟：設計多條與目標核酸序列結合的雜交序列；通過質粒構建得到串聯重復的標記序列；將雜交序列和標記序列的重復片段串聯，之后將得到的產物回收并利用外切酶消化，將得到的單鏈DNA探針標記，得到熒光原位雜交探針。本發明通過修飾引物PCR將雜交序列與標記序列串聯，利用相應的序列特異性核酸結合蛋白融合熒光蛋白等將信號引導并結合到標記序列，降低了傳統寡鏈引物化學修飾較高的費用，串聯重復的序列和多探針的探針組設置顯著提高了信號強度；通過外切酶將所得雙鏈PCR產物進行有限消化獲得單鏈末端，比雙鏈探針達到更好的雜交效果；操作簡單，成本低。

技術領域

本發明涉及分子生物學檢測技術領域，具體涉及一種熒光原位雜交探針及其制備方法與應用。

背景技術

原位雜交是通過特定標記的已知核酸序列為探針與細胞或組織切片核酸序列進行精確定位的過程。因此可以借助于原位雜交得到細胞中特定RNA或DNA的位置信息，對分子水平的機制做出判斷。

目前熒光原位雜交的探針中的寡鏈核苷酸的制備和標記較為復雜，合成寡鏈核苷酸引物需要通過化學修飾將熒光基團或生物素等連接到引物上，制備成本較高。

發明內容

針對現有技術中的缺陷，本發明目的在于提供一種熒光原位雜交探針及其制備方法與應用，以解決原位雜交探針中寡鏈核苷酸制備操作復雜、化學修飾成本較高不適合大量制備等問題。

為實現上述目的，本發明提供的技術方案為：

第一方面，本發明提供了一種熒光原位雜交探針的制備方法，包括步驟：設計多條與目標核酸序列結合的雜交序列；通過質粒構建得到串聯重復的標記序列；將雜交序列和標記序列的重復片段串聯，之后將得到的產物回收并利用外切酶消化，得到單鏈DNA探針；將單鏈DNA探針進行標記，得到熒光原位雜交探針。

優選地，熒光原位雜交探針的制備方法中，多條為3-20條；雜交序列的長度為30-40bp。長度30-40bp可以適當增加雜交的特異性，多條探針組成的探針組可以增加信號強度。

優選地，熒光原位雜交探針的制備方法中，標記序列為能與序列特異性核酸結合蛋白如LacI結合的DNA序列如乳糖操縱子LacO。

優選地，熒光原位雜交探針的制備方法中，通過質粒構建得到串聯重復的標記序列具體包括：在質粒上構建得到串聯重復的標記序列，如如乳糖操縱子LacO的變體Osys，兩個相鄰的標記序列間隔為10-20bp，優選為15bp；串聯重復序列以2段序列(2X序列)為基礎，以一對同尾酶分別位于2段序列(2X序列)兩端，另一限制性內切酶位于外圍，通過同尾酶粘性末端連接，以此重復酶切連接，得到8-32段重復(8-32X)的標記序列。

優選地，熒光原位雜交探針的制備方法中，將雜交序列和標記序列的重復片段串聯具體包括：通過修飾引物PCR用5’端攜帶雜交序列的修飾引物和另一反向引物以標記序列的突變體為模板，將雜交序列和標記序列的重復片段串聯，所得片段在標記序列兩端延長20bp以上。

優選地，熒光原位雜交探針的制備方法中，將得到的產物回收并利用外切酶消化具體為將得到的PCR產物回收并利用T5外切酶有限消化；單鏈DNA探針為末端具有30-40nt單鏈DNA片段。

優選地，熒光原位雜交探針的制備方法中，將單鏈DNA探針進行熒光標記具體包括：將單鏈DNA探針與樣品雜交后洗滌，洗滌是依次采用wash buffer1和wash buffer2進行洗滌，再加入融合蛋白于37℃孵育30min，之后加入DAPI染色孵育5min即可；其中，融合蛋白是將結合蛋白與第一蛋白融合表達并純化制備而得，如LacI-eGFP；第一蛋白為熒光蛋白和/或報告酶。

第二方面，本發明還保護根據上述方法制備得到的熒光原位雜交探針。