[發明專利]熒光原位雜交探針及其制備方法與應用

在審

• 申請號: 202011218809.3
• 申請日: 2020-11-04
• 公開（公告）號: CN112266947A
• 公開（公告）日: 2021-01-26
• 發明（設計）人: 陳靜
• 申請（專利權）人: 南偲生物科技（南京）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6841;C12N15/11
• 代理公司: 北京酷愛智慧知識產權代理有限公司 11514
• 代理人: 王靜

1.一種熒光原位雜交探針的制備方法，其特征在于，包括步驟：

設計多條與目標核酸序列結合的雜交序列；通過質粒構建得到串聯重復的標記序列；將所述雜交序列和所述標記序列的重復片段串聯，之后將得到的產物回收并利用外切酶消化，得到單鏈DNA探針；將所述單鏈DNA探針進行標記，得到熒光原位雜交探針。

2.根據權利要求1所述的熒光原位雜交探針的制備方法，其特征在于：

所述多條為3-20條；所述雜交序列的長度為30-40bp。

3.根據權利要求1所述的熒光原位雜交探針的制備方法，其特征在于：

所述標記序列為能與序列特異性核酸結合蛋白結合的DNA序列。

4.根據權利要求1所述的熒光原位雜交探針的制備方法，其特征在于，

所述通過質粒構建得到串聯重復的標記序列具體包括：在質粒上構建得到串聯重復的標記序列，兩個相鄰的標記序列間隔為10-20bp，優選為15bp；串聯重復序列以2段序列為基礎，以一對同尾酶分別位于2段序列兩端，另一限制性內切酶位于外圍，通過同尾酶粘性末端連接，以此重復酶切連接，得到8-32段重復的標記序列。

5.根據權利要求1所述的熒光原位雜交探針的制備方法，其特征在于，

將所述雜交序列和所述標記序列的重復片段串聯具體包括：通過修飾引物PCR用5’端攜帶所述雜交序列的修飾引物和另一反向引物以所述標記序列的突變體為模板，將所述雜交序列和所述標記序列的重復片段串聯，所得片段在標記序列兩端延長20bp以上。

6.根據權利要求1所述的熒光原位雜交探針的制備方法，其特征在于：

將得到的產物回收并利用外切酶消化具體為將得到的PCR產物回收并利用T5外切酶有限消化；

所述單鏈DNA探針為末端具有30-40nt單鏈DNA片段。

7.根據權利要求1所述的熒光原位雜交探針的制備方法，其特征在于，

將所述單鏈DNA探針進行熒光標記具體包括：將所述單鏈DNA探針與樣品雜交后洗滌，再加入融合蛋白于37℃孵育30min，之后加入DAPI染色孵育5min即可；其中，所述融合蛋白是將結合蛋白與第一蛋白融合表達并純化制備而得；所述第一蛋白為熒光蛋白和/或報告酶。

8.權利要求1-7任一項所述的方法制備得到的熒光原位雜交探針。

9.權利要求8所述的熒光原位雜交探針在制備用于熒光原位雜交檢測產品中的應用。

10.一種熒光原位雜交檢測試劑盒，其特征在于：

所述熒光原位雜交檢測試劑盒包括權利要求8所述的熒光原位雜交探針。