[發(fā)明專利]一種高效的細(xì)胞系基因敲除系統(tǒng)

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011218342.2
• 申請日: 2020-11-04
• 公開（公告）號: CN113462720B
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔣棟;王江華;謝興旺;王雪艷;畢晶磊;史云強(qiáng)
• 申請（專利權(quán)）人: 北京可瑞生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/12;C12N5/10
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 黃爽

本發(fā)明提供一種高效的細(xì)胞系基因敲除系統(tǒng)，通過構(gòu)建通用的高效細(xì)胞系基因敲除系統(tǒng)，將含有轉(zhuǎn)錄終止信號的外源基因片段，插入特定基因的啟動子下游，阻斷mRNA轉(zhuǎn)錄。基于本系統(tǒng)的設(shè)計，無需為每次基因敲除單獨(dú)設(shè)計含有同源臂的供體質(zhì)粒。使用能夠靶向特定基因位點(diǎn)的sgRNA，結(jié)合本發(fā)明構(gòu)建的相關(guān)供體質(zhì)粒系統(tǒng)，即可以快速實(shí)施特定基因的敲除和純合敲除克隆的篩選。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種高效的細(xì)胞系基因敲除系統(tǒng)。

背景技術(shù)

隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，目前細(xì)胞系基因敲除主要采用ZFN、TALEN和CRISPR等技術(shù)，在編碼基因N端的ORF序列中制造雙鏈DNA斷點(diǎn)(DSB)，在細(xì)胞內(nèi)修復(fù)機(jī)制作用下形成插入缺失Indel，通過造成突變位點(diǎn)后序列的移碼突變，破壞蛋白的表達(dá)。但是很多基因具有可變剪切的RNA形式，單純破壞某個外顯子，有可能無法充分破壞基因的所有轉(zhuǎn)錄本。有研究發(fā)現(xiàn)，基因編輯過程在某些外顯子上制造的突變，甚至導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生新的可變剪切體，編碼具有生物活性的目的蛋白。

為了確保基因的轉(zhuǎn)錄被妥善地阻斷，可以利用斷點(diǎn)兩側(cè)的同源臂和外源的基因片段構(gòu)建供體質(zhì)粒，將能夠阻斷RNA轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止元件引入目的基因的5’端，從而徹底阻斷目的基因的轉(zhuǎn)錄。但是需要為每一個基因敲除的編輯位點(diǎn)設(shè)計供體質(zhì)粒，構(gòu)建過程耗時耗力。而且，基于同源重組的外源基因插入效率低下，重組效率常常低于5％，甚至低于1％，非常不利于后續(xù)克隆鑒定工作的開展。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種高效的細(xì)胞系基因敲除系統(tǒng)。

本發(fā)明構(gòu)思如下：通過構(gòu)建一種通用的高效細(xì)胞系基因敲除系統(tǒng)，將含有轉(zhuǎn)錄終止信號的外源基因片段，插入特定基因的啟動子下游，阻斷mRNA轉(zhuǎn)錄。基于本系統(tǒng)的設(shè)計，無需為每次基因敲除單獨(dú)設(shè)計含有同源臂的供體質(zhì)粒。使用能夠靶向特定基因位點(diǎn)的sgRNA，結(jié)合本發(fā)明構(gòu)建的相關(guān)供體質(zhì)粒系統(tǒng)，即可以快速實(shí)施特定基因的敲除和純合敲除克隆的篩選。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，第一方面，本發(fā)明提供一種基于CRISPR基因敲除系統(tǒng)的通用供體質(zhì)粒(Donor質(zhì)粒/Donor載體)，由Donor①～Donor③共三條供體質(zhì)粒組成；

Donor①包含如下元件：5′-非人源sgRNA靶序列-供體DNA片段F①-LoxP-報告基因-LoxP-終止子-非人源sgRNA靶序列-3′；

Donor②包含如下元件：5′-非人源sgRNA靶序列-供體DNA片段F②-LoxP-報告基因-LoxP-終止子-非人源sgRNA靶序列-3′；

Donor③包含如下元件：5′-非人源sgRNA靶序列-供體DNA片段F③-LoxP-報告基因-LoxP-終止子-非人源sgRNA靶序列-3′；

Donor①～Donor③中，5′、3′端的非人源sgRNA靶序列相同；

供體DNA片段F①的長度為三聯(lián)密碼子3的整數(shù)倍；

供體DNA片段F②的長度為三聯(lián)密碼子3的整數(shù)倍+2；

供體DNA片段F③的長度為三聯(lián)密碼子3的整數(shù)倍+1。

優(yōu)選地，供體DNA片段F②為三聯(lián)密碼子3的整數(shù)倍+GG(位于供體DNA片段5’端)，供體DNA片段F③為三聯(lián)密碼子3的整數(shù)倍+G(位于供體DNA片段5’端)。

第二方面，本發(fā)明提供另一種基于CRISPR基因敲除系統(tǒng)的通用供體質(zhì)粒(Donor質(zhì)粒/Donor載體)，由Donor1～Donor3共三條供體質(zhì)粒組成；

Donor1包含如下元件：5′-非人源sgRNA靶序列-供體DNA片段F1-LoxP-2A自剪切肽-報告基因-2A自剪切肽-胸苷激酶基因-PEST基因-LoxP-終止子-非人源sgRNA靶序列-3′；