[發(fā)明專利]一種高效的細(xì)胞系基因敲除系統(tǒng)有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202011218342.2 | 申請日： | 2020-11-04 |
| 公開（公告）號： | CN113462720B | 公開（公告）日： | 2022-03-25 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 蔣棟;王江華;謝興旺;王雪艷;畢晶磊;史云強(qiáng) | 申請（專利權(quán)）人： | 北京可瑞生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/85 | 分類號： | C12N15/85;C12N15/12;C12N5/10 |
| 代理公司： | 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002 | 代理人： | 黃爽 |
| 地址： | 102200 北京市昌平區(qū)*** | 國省代碼： | 北京;11 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 高效 細(xì)胞系 基因 系統(tǒng) | ||
1.基于CRISPR基因敲除系統(tǒng)的通用供體質(zhì)粒，其特征在于，由Donor①～Donor③共三條供體質(zhì)粒組成；
Donor①包含如下元件：5′-非人源sgRNA靶序列-供體DNA片段F①-LoxP-報(bào)告基因-LoxP-終止子-非人源sgRNA靶序列-3′；
Donor②包含如下元件：5′-非人源sgRNA靶序列-供體DNA片段F②-LoxP-報(bào)告基因-LoxP-終止子-非人源sgRNA靶序列-3′；
Donor③包含如下元件：5′-非人源sgRNA靶序列-供體DNA片段F③-LoxP-報(bào)告基因-LoxP-終止子-非人源sgRNA靶序列-3′；
Donor①～Donor③中，5′、3′端的非人源sgRNA靶序列相同；
供體DNA片段F①的長度為三聯(lián)密碼子3的整數(shù)倍；
供體DNA片段F②的長度為三聯(lián)密碼子3的整數(shù)倍+2；
供體DNA片段F③的長度為三聯(lián)密碼子3的整數(shù)倍+1。
2.基于CRISPR基因敲除系統(tǒng)的通用供體質(zhì)粒，其特征在于，由Donor1～Donor3共三條供體質(zhì)粒組成；
Donor1包含如下元件：5′-非人源sgRNA靶序列-供體DNA片段F1-LoxP-2A自剪切肽-報(bào)告基因-2A自剪切肽-胸苷激酶基因-PEST基因-LoxP-終止子-非人源sgRNA靶序列-3′；
Donor2包含如下元件：5′-非人源sgRNA靶序列-供體DNA片段F2-LoxP-2A自剪切肽-報(bào)告基因-2A自剪切肽-胸苷激酶基因-PEST基因-LoxP-終止子-非人源sgRNA靶序列-3′；
Donor3包含如下元件：5′-非人源sgRNA靶序列-供體DNA片段F3-LoxP-2A自剪切肽-報(bào)告基因-2A自剪切肽-胸苷激酶基因-PEST基因-LoxP-終止子-非人源sgRNA靶序列-3′；
Donor1～Donor3中，5′、3′端的非人源sgRNA靶序列相同；
供體DNA片段F1的長度為三聯(lián)密碼子3的整數(shù)倍；
供體DNA片段F2的長度為三聯(lián)密碼子3的整數(shù)倍+2；
供體DNA片段F3的長度為三聯(lián)密碼子3的整數(shù)倍+1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的通用供體質(zhì)粒，其特征在于，所述非人源sgRNA靶序列為編碼GFP的核酸序列、擬南芥的Tail序列或其它與人基因組序列或擬敲除細(xì)胞基因組序列同源性很低的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的通用供體質(zhì)粒，其特征在于，供體DNA片段F②為三聯(lián)密碼子3的整數(shù)倍+GG，供體DNA片段F③為三聯(lián)密碼子3的整數(shù)倍+G；和/或
供體DNA片段F2為三聯(lián)密碼子3的整數(shù)倍+GG，供體DNA片段F3為三聯(lián)密碼子3的整數(shù)倍+G。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的通用供體質(zhì)粒，其特征在于，所述通用供體質(zhì)粒中選用的報(bào)告基因的種類與待敲除靶基因的等位基因數(shù)量一致。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的通用供體質(zhì)粒，其特征在于，所述報(bào)告基因?yàn)榭股乜剐曰颉?/p>
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的通用供體質(zhì)粒，其特征在于，終止子為串聯(lián)的poly A序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的通用供體質(zhì)粒，其特征在于，終止子為反向串聯(lián)的SV40PolyA和BGH PolyA序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的通用供體質(zhì)粒，其特征在于，2A自剪切肽選自T2A、P2A、E2A或F2A；和/或
胸苷激酶基因?yàn)門K2或TK007基因；和/或
PEST基因來自小鼠、大鼠或人工改造而成。
10.一種高效的細(xì)胞系基因敲除系統(tǒng)，其特征在于，包括：編碼CRISPR系統(tǒng)Cas蛋白的質(zhì)粒、靶基因特異性sgRNA質(zhì)粒、權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述通用供體質(zhì)粒以及靶向所述通用供體質(zhì)粒中非人源sgRNA靶序列的sgRNA質(zhì)粒。
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