[發(fā)明專利]一種表達(dá)載體及其在制備轉(zhuǎn)基因棕色棉花中的應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011216020.4
• 申請(qǐng)日: 2020-11-04
• 公開（公告）號(hào): CN112359056A
• 公開（公告）日: 2021-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林忠旭;張獻(xiàn)龍;汪念;張貝貝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;C12N15/29;C12N1/21;A01H5/00;A01H6/60;C12R1/01
• 代理公司: 武漢智嘉聯(lián)合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 42231
• 代理人: 丁倩

本發(fā)明公開了一種表達(dá)載體及其在制備轉(zhuǎn)基因棕色棉花中的應(yīng)用，屬于棉花基因工程技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體Gb_expa2::Gh_RE，其中包含如序列表SEQ ID NO.1所示的紅株突變體基因Gh_RE和如序列表SEQ ID NO.2所示的啟動(dòng)子Gb_expa2，并將該表達(dá)載體導(dǎo)入到棉花的宿主細(xì)胞中，從而在伸長期的棉花纖維中高量表達(dá)Gh_RE，在發(fā)育的纖維中產(chǎn)生花青素積累，并最終在成熟的棉花纖維中產(chǎn)生明顯的色素積累，表現(xiàn)出明顯的棕色，即本發(fā)明通過基因工程技術(shù)得到了一種新的棉花棕色纖維材料，并為在纖維中產(chǎn)生色素積累提供了新思路。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于棉花基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種表達(dá)載體及其在制備轉(zhuǎn)基因棕色棉花中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，在紡織工業(yè)中有著舉足輕重的作用，與人民生活息息相關(guān)，有重要的研究意義。葉色突變體因?yàn)楸硇兔黠@，受到育種家們的關(guān)注，并被嘗試用于作物選擇育種。棉花中的紅株突變體因?yàn)橛幸欢ǖ目瓜x性，一直受到研究者們的青睞。如何更好利用紅株基因還有待更多的嘗試。

彩色棉是一種能在纖維中積累色素并表現(xiàn)出一定色彩的棉花特殊材料，能減少漂白與染色加工，避免一些殘留的化學(xué)試劑對(duì)皮膚的不友好。隨著人們綠色消費(fèi)觀念的增強(qiáng)，天然的彩色棉產(chǎn)品會(huì)受到更多人的喜愛，彩色棉也會(huì)有更好的發(fā)展市場(chǎng)與前景。

葉色突變與彩色棉形成的主要原因都是花青素在特定部位的過量積累，有趣的是，紅株突變體植株的莖葉在全生育期都表型出明顯的紅紫色，但棉絮卻是正常的白色。而彩色棉材料除了棉絮表現(xiàn)出特殊色彩，植株本身卻和正常棉花植株相差無幾。棕色棉是目前最常見、應(yīng)用也最廣的彩色棉。Wen等(2017)收集了100份棕色棉材料，并通過連鎖和關(guān)聯(lián)作圖揭示了棕色棉的遺傳基礎(chǔ)。Yan等(2018)通過在棉花纖維次生壁增厚期上調(diào)表達(dá)GhTT2-3A，使纖維表現(xiàn)出棕色。

紅株突變體來自于陸地棉鄂棉22(E22)和海島棉3-79雜交F1的回交后代，通過基因定位、表達(dá)量檢測(cè)、基因克隆以及功能驗(yàn)證，找到紅株內(nèi)源突變體基因，一個(gè)R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子，將其命名為Gh_RE，在棉花三代參考基因組中(Wang,M.,Tu,L.,Yuan,D.etal.Reference genome sequences of two cultivated allotetraploid cottons,Gossypium hirsutum and Gossypium barbadense.Nat Genet 51,224-229.2019)，基因ID為Ghir_D07G008560。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中彩色棉種質(zhì)稀少，并且顏色單一的缺陷，將紅株內(nèi)源突變體基因Gh_RE的編碼區(qū)序列與包含有啟動(dòng)子Gb_expa2的載體連接得到表達(dá)載體Gb_expa2::Gh_RE，將其導(dǎo)入棉花宿主細(xì)胞，使Gh_RE基因在纖維伸長期的纖維中高量表達(dá)，使最終的成熟纖維產(chǎn)生色素積累，從而制備得到了一種轉(zhuǎn)基因棕色棉新品種。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種表達(dá)載體Gb_expa2::Gh_RE，包含紅株突變體基因Gh_RE和啟動(dòng)子Gb_expa2，其中所述紅株突變體基因Gh_RE的序列如序列表SEQ ID NO.1所示，所述啟動(dòng)子Gb_expa2的序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明還提供了一種遺傳工程菌，所述遺傳工程菌包含上述表達(dá)載體。

本發(fā)明還提供了所述表達(dá)載體或所述遺傳工程菌在制備轉(zhuǎn)基因棕色棉花中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了所述表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括：以紅株突變體的cDNA為模板，擴(kuò)增得到SEQ ID NO.1所示的序列，并與包含有啟動(dòng)子Gb_expa2的載體連接，即得到所述表達(dá)載體。

進(jìn)一步的，以紅株突變體的cDNA為模板，以SEQ ID NO.3-4所述的序列為引物，擴(kuò)增得到SEQ ID NO.1所示的序列。