[發(fā)明專利]一種表達(dá)載體及其在制備轉(zhuǎn)基因棕色棉花中的應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011216020.4
• 申請(qǐng)日: 2020-11-04
• 公開（公告）號(hào): CN112359056A
• 公開（公告）日: 2021-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林忠旭;張獻(xiàn)龍;汪念;張貝貝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;C12N15/29;C12N1/21;A01H5/00;A01H6/60;C12R1/01
• 代理公司: 武漢智嘉聯(lián)合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 42231
• 代理人: 丁倩

1.一種表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體包含紅株突變體基因Gh_RE和啟動(dòng)子Gb_expa2，其中所述紅株突變體基因Gh_RE的序列如序列表SEQ ID NO.1所示，所述啟動(dòng)子Gb_expa2的序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

2.一種遺傳工程菌，其特征在于，所述遺傳工程菌包含權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體。

3.權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體或權(quán)利要求2所述的遺傳工程菌在制備轉(zhuǎn)基因棕色棉花中的應(yīng)用。

4.一種權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括：以紅株突變體的cDNA為模板，擴(kuò)增得到SEQ ID NO.1所示的序列，并與包含有啟動(dòng)子Gb_expa2的載體連接，即得到所述表達(dá)載體。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，以紅株突變體的cDNA為模板，以SEQID NO.3-4所述的序列為引物，擴(kuò)增得到SEQ ID NO.1所示的序列。

6.一種轉(zhuǎn)基因棕色棉花的制備方法，其特征在于，所述方法包括：將權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入棉花宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞表達(dá)即得所述轉(zhuǎn)基因棕色棉花。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述方法包括：

步驟1、按權(quán)利要求4或5所述的構(gòu)建方法得到表達(dá)載體，并將表達(dá)載體導(dǎo)入到農(nóng)桿菌中，并用農(nóng)桿菌活化培養(yǎng)基懸浮得到農(nóng)桿菌菌液；

步驟2、選取棉花種子剝?nèi)シN皮，滅菌后接種于無(wú)菌苗培養(yǎng)基中，得到無(wú)菌苗下胚軸；

步驟3、將步驟2得到的無(wú)菌苗下胚軸切成小段后接種于步驟1的農(nóng)桿菌菌液中進(jìn)行侵染，接著轉(zhuǎn)移到無(wú)菌濾紙上吸干殘留菌液；

步驟4、將步驟3得到的侵染后的無(wú)菌苗下胚軸接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，于21℃下共培養(yǎng)48h；

步驟5、接著轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得胚性愈傷組織，然后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因幼苗后轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，直至獲得完整的轉(zhuǎn)基因植株。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述方法還包括：轉(zhuǎn)基因植株的陽(yáng)性鑒定，即提取步驟5得到的轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，并以序列表SEQ ID NO.5-6所示序列作為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和鑒定。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述方法還包括：Gh_RE基因表達(dá)量的檢測(cè)，即提取步驟5得到的轉(zhuǎn)基因植株的總RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板，以序列表SEQ ID NO.7-8所示序列作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測(cè)。

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟1中所述農(nóng)桿菌活化培養(yǎng)基包括：胰化蛋白胨、NaCl、MgSO4、KH₂PO₄、甘露醇和甘氨酸；

步驟2中所述無(wú)菌苗培養(yǎng)基包括：1/2MS培養(yǎng)基、葡萄糖和Phytagel；

步驟4中所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基包括：MSB培養(yǎng)基、2,4-D、激動(dòng)素、乙酰丁香酮、葡萄糖和Phytagel；

步驟5中所述選擇培養(yǎng)基包括：MSB培養(yǎng)基、2,4-D、激動(dòng)素、葡萄糖、Phytagel、卡那霉素、頭孢霉素；

步驟5中所述分化培養(yǎng)基包括：不含有NH₄NO₃且KNO₃含量加倍的MSB培養(yǎng)基、吲哚丁酸、激動(dòng)素、葡萄糖、谷氨酰胺、天冬酰胺和Phytagel；

步驟5中所述生根培養(yǎng)基包括：MSB培養(yǎng)基、谷氨酰胺、天冬酰胺和Phytagel。