[發明專利]A型塞內卡病毒全長感染性cDNA克隆及其構建方法及應用

有效

• 申請號: 202011215796.4
• 申請日: 2020-11-04
• 公開（公告）號: CN112301042B
• 公開（公告）日: 2022-09-16
• 發明（設計）人: 馬雪青;孫普;李平花;盧曾軍;劉在新;曹軼梅;白興文;付元芳;張婧;李坤
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/41
• 分類號: C12N15/41;C12N15/63;A61K39/125;A61P31/14
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 薛紅凡

本發明提供了A型塞內卡病毒SVA/HN/11/2017蘭獸研全長感染性cDNA克隆及其構建方法及應用，屬于病毒技術領域。本發明在對SVA/HN/11/2017蘭獸研進行全基因組測定的基礎上，在其基因組cDNA序列的5’端引入了T7啟動子序列，在3’端引入Not I酶切位點序列，同時在2B基因處引入了Xho I酶切位點，消除了Xma I酶切位點，構建含SVA/HN/11/2017蘭獸研全長cDNA的重組質粒。基于感染性cDNA克隆拯救得到的病毒在制備A型塞內卡病毒標記疫苗中的應用。本發明提供的感染性cDNA克隆及制備方法為深入開展SVA的基礎和應用研究提供了有效的平臺，具有重要的科學應用價值。

技術領域

本發明屬于病毒技術領域，具體涉及A型塞內卡病毒SVA/HN/11/2017蘭獸研全長感染性cDNA克隆及其構建方法及應用。

背景技術

A型塞內卡病毒(Senecavirus A，SVA)是一種無囊膜的單股正鏈RNA病毒，是引起豬出現水泡性病變的病原。SVA感染導致的臨床癥狀包括在豬鼻鏡、口腔上皮及蹄冠處出現水皰、潰爛從而導致跛行，在小日齡仔豬中會引起嗜睡、腹瀉、神經系統癥狀和急性死亡，0～3日齡的仔豬死亡率高達(40％～80％)，4～7日齡的仔豬死亡率達(0～30％)。SVA感染引起的臨床癥狀與口蹄疫、豬水泡病、水皰性口炎和豬水皰疹引起的病變相似，在臨床上難以區分。

SVA是小RNA病毒科(Picornaviridae)塞內卡病毒屬(Senecavirus)的唯一成員，其基因組為單股正鏈RNA，全長約7.28Kb，依次由5′-非翻譯區(Untranslated region，UTR)(0.66Kb)、開放閱讀框(Open reading frame，ORF)(6.54Kb)和3′-UTR(0.07Kb)組成。SVA的ORF編碼一個大的多聚蛋白前體，然后經蛋白酶剪切后形成4種結構蛋白(VP4，VP2，VP3和VP1)和8種非結構蛋白(L，2A，2B，2C，3A，3B，3C和3D)。

SVA最早于2002年從胚胎視網膜細胞(PRR.C6)培養物中首次分離得到，該分離株被命名為SVV-001。盡管調查發現SAV自1988年就在美國的豬群中流行，但并未確診；直到2007年，才從加拿大運往美國的患有水皰樣癥狀的豬中檢測到SVA RNA陽性，而能引起豬水皰癥狀的口蹄疫病毒、水皰性口炎病毒、豬水皰病病毒和水皰性疹病毒的病原學檢測均為陰性，而從認為SVA是導致被檢豬只發生水皰性疾病的病原。目前，國內外研究人員對SVA在生物學特性、診斷試劑和疫苗研究等方面做了一些工作，然而SVA的感染與復制機理仍不清楚。

反向遺傳學(Reverse Genetics)是相對于經典遺傳學而言的。經典遺傳學是由表及里，即從生物的性狀、表型到遺傳物質來研究生命的發生與發展規律；而反向遺傳學則是直接從生物的遺傳物質入手來闡述生物生命發生的本質現象，即在獲得生物基因信息的基礎上，有目的地對生物體基因組進行加工和修飾，如定點突變、基因插入/缺失、基因置換等，來研究這些修飾對生物體的表型、性狀的影響等，從而揭示該基因與表型的關系。

反向遺傳操作技術的興起使得人們可以在DNA水平上對病毒基因組進行各種修飾和改造，然后通過拯救病毒的表型變化來判斷這些基因操作的效果，從而對病毒基因組的表達調控機制、病毒的致病機理等進行研究。然而與DNA病毒和反轉錄病毒不同，大多數RNA病毒由于其基因組本身的結構特點和不穩定性，同時在其復制期間不經歷DNA中間階段，增加了研究的難度。但隨著RT-PCR和體外轉錄RNA技術的發展，一種名為反向遺傳學的操作技術，克服了對RNA病毒基因組難以操作的難題，可以通過操作其相對穩定的cDNA而在分子水平上進一步研究RNA病毒。