[發明專利]A型塞內卡病毒全長感染性cDNA克隆及其構建方法及應用

有效

• 申請號: 202011215796.4
• 申請日: 2020-11-04
• 公開（公告）號: CN112301042B
• 公開（公告）日: 2022-09-16
• 發明（設計）人: 馬雪青;孫普;李平花;盧曾軍;劉在新;曹軼梅;白興文;付元芳;張婧;李坤
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/41
• 分類號: C12N15/41;C12N15/63;A61K39/125;A61P31/14
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 薛紅凡

1.A型塞內卡病毒SVA/HN/11/2017蘭獸研全長感染性cDNA克隆，其特征在于，在載體的多克隆位點處插入含T7啟動子的SVA/HN/11/2017蘭獸研全長cDNA核苷酸序列；

所述含T7啟動子的SVA/HN/11/2017蘭獸研全長cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根據權利要求1所述A型塞內卡病毒SVA/HN/11/2017蘭獸研全長感染性cDNA克隆，其特征在于，所述載體為M-pSK載體。

3.根據權利要求1或2所述A型塞內卡病毒SVA/HN/11/2017蘭獸研全長感染性cDNA克隆，其特征在于，所述多克隆位點為KpnI/NotI。

4.權利要求1~3任意一項所述A型塞內卡病毒SVA/HN/11/2017蘭獸研全長感染性cDNA克隆的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）以A型塞內卡病毒SVA/HN/11/2017蘭獸研的RNA為模板，分別用引物對S1F/S1R、S2F/SmR、SmF/S2R和S3F/S3R進行RT-PCR擴增，獲得擴增產物分別為S1、Sm1、Sm2和S3片段；

所述S1F的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述S1R的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述S2F的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述SmR的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述SmF的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

所述S2R的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；

所述S3F的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

所述S3R的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；

2）利用融合PCR將得到的Sm1和Sm2片段進行融合，獲得S2片段；

3）將所述S1、S2和S3片段克隆到載體中，獲得包含SVA基因組全長cDNA的克隆。

5.根據權利要求4所述A型塞內卡病毒SVA/HN/11/2017蘭獸研全長感染性cDNA克隆的構建方法，其特征在于，所述RT-PCR擴增的反應程序：50℃，30min；94℃，2min；然后94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸130s，共30個循環；最后72℃延伸10min。

6.根據權利要求4所述A型塞內卡病毒SVA/HN/11/2017蘭獸研全長感染性cDNA克隆的構建方法，其特征在于，所述融合PCR是以所述Sm1和Sm2片段為模板，以所述S2F和S2R為引物對進行融合PCR擴增；

所述融合PCR擴增的反應程序：94℃預變性5min；然后98℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸200s，共35個循環；最后72℃延伸10min。

7.根據權利要求4所述A型塞內卡病毒SVA/HN/11/2017蘭獸研全長感染性cDNA克隆的構建方法，其特征在于，S1片段克隆到載體的多克隆位點為Kpn I/NdeI；

S2片段克隆到載體的多克隆位點為Nde I/Bgl II；

S3片段克隆到載體的多克隆位點為Bgl II/Not I。

8.權利要求1~3任意一項所述A型塞內卡病毒SVA/HN/11/2017蘭獸研全長感染性cDNA克隆在拯救A型塞內卡病毒中的應用。

9.基于權利要求1~3任意一項所述A型塞內卡病毒SVA/HN/11/2017蘭獸研全長感染性cDNA克隆拯救得到的病毒rSVA-HN，其特征在于，通過沉默突變在2B基因處引入了一個XhoI酶切位點，同時消除了一個Xma I 酶切位點；

所述病毒rSVA-HN和親本病毒SVA/HN/11/2017蘭獸研株的形態結構、大小、感染性、生長速度及病毒效價一致。

10.權利要求9所述病毒rSVA-HN在制備A型塞內卡病毒標記疫苗中的應用。