[發明專利]抗地西泮單鏈抗體的制備方法、產品及地西泮檢測方法

有效

• 申請號: 202011214931.3
• 申請日: 2020-11-04
• 公開（公告）號: CN112375148B
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發明（設計）人: 徐澤華;孫鐵強;韓振宇;劉肖;張櫻櫻;范龍興;白家磊;寧保安
• 申請（專利權）人: 軍事科學院軍事醫學研究院環境醫學與作業醫學研究所
• 主分類號: C07K16/46
• 分類號: C07K16/46;C07K1/22;C12N15/13;C12N15/85;G01N33/543;G01N33/53
• 代理公司: 北京豐浩知識產權代理事務所(普通合伙) 11781
• 代理人: 董超

本發明涉及生物檢測領域，具體講，涉及一種抗地西泮單鏈抗體的制備方法、產品及地西泮的檢測方法。本發明的制備方法包括構建scFv基因片段、scFv?Fc抗體的表達和純化。本發明制備得到的抗地西泮單鏈抗體相比親代地西泮單抗隆抗體靈敏度有明顯提高，并具有良好的特異性。

技術領域

本發明涉及生物檢測領域，具體講，涉及一種抗地西泮單鏈抗體的制備方法、產品及地西泮檢測方法。

背景技術

地西泮(Diazepam，DZP)又名安定，屬苯二氮卓類藥物，臨床上常用治療于失眠、驚厥、焦慮等精神疾病；小劑量短期服用通常是安全有效的，但大劑量服用可抑制中樞神經、抑制呼吸、引起中毒，長期攝入也會形成依賴性或成癮性。雖然，我國已明令禁止在飼料和動物飲用水中使用DZP等苯二氮卓類藥物，但是，由于經濟利益、其高效的藥物作用等原因，DZP的濫用現象依然嚴重。某些企業為追求高額利潤，在動物飲用水、飼料中非法添加DZP，致使動物性食品中存在DZP殘留；DZP與酒精等抑制類物質共同食用會提高DZP的鎮靜作用，提高藥物吸收率；一些不法分子向酒水中添加大劑量的DZP等藥物，進行性暴力、搶劫等犯罪活動，給社會的健康發展造成了極為不利的影響。因此，針對DZP殘留的快速、靈敏的檢測是有十分必要的，對有效監控DZP殘留和維護社會治安具有積極的意義。

目前DZP的檢測方法主要為色譜技術，如高效液相色譜法、氣相色譜法、色譜-質譜聯用法等。其所需儀器昂貴，需配有專業操作人員，樣品前處理繁瑣，難以得到普及，不適用于基層和現場的檢測。而免疫技術因其靈敏性好、特異性高、成本低、檢測快速等優勢一直備受親睞，其中酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是最為常用的檢測方法。由于某些精神類藥物的抗體很難制備，目前針對DZP的單克隆抗體和多克隆抗體的研究并不多見，在一定程度上限制了ELISA技術的廣泛應用。而利用基因工程技術制備的重組抗體，既保留了天然抗體的生物學活性和特異性，又具有經濟性好的優勢，成為研究者的關注熱點。

1988年由Bird和Huston最先成功獲得的單鏈抗體(single chain fragmentviarable，scFv)，是一種利用基因工程技術將傳統抗體重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)通過一段約5～25個氨基酸連接肽首尾拼接而成的重組抗體。因其具有分子量小、特異性高、易改造等優勢，被廣泛應用于生物技術和臨床醫藥等領域。

鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的首要發明目的在于提供一種抗地西泮單鏈抗體的制備方法。

本發明的第二發明目的在于提供該方法制備得到的抗地西泮單鏈抗體。

本發明的第三發明目的在于提供一種地西泮檢測方法。

為了完成本發明的發明目的，采用的技術方案為：

本發明提出一種抗地西泮單鏈抗體的制備方法，至少包括以下步驟：

S1、構建scFv基因片段：設計抗地西泮抗體的VH基因片段和VL基因片段的核苷酸序列并進行人工合成，所述VH基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述VL基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，將所述VH基因片段與所述VL基因片段擴增后連接得到所述scFv基因片段；

S2、scFv-Fc抗體的表達：將所述scFv基因片段連入含有人IgG1 Fc的pFUSE_hIgG1e5_Fc2質粒中，構建得到pFUSE_hIgG1e5_Fc2-scFv重組質粒，轉染表達細胞，融和表達所述scFv-Fc抗體；

S3、純化：收集表達細胞的上清液，純化后，即得所述抗地西泮單鏈抗體。

可選的，擴增VH基因片段的引物如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示，擴增VL基因片段的引物如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示；