[發明專利]抗地西泮單鏈抗體的制備方法、產品及地西泮檢測方法

有效

• 申請號: 202011214931.3
• 申請日: 2020-11-04
• 公開（公告）號: CN112375148B
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發明（設計）人: 徐澤華;孫鐵強;韓振宇;劉肖;張櫻櫻;范龍興;白家磊;寧保安
• 申請（專利權）人: 軍事科學院軍事醫學研究院環境醫學與作業醫學研究所
• 主分類號: C07K16/46
• 分類號: C07K16/46;C07K1/22;C12N15/13;C12N15/85;G01N33/543;G01N33/53
• 代理公司: 北京豐浩知識產權代理事務所(普通合伙) 11781
• 代理人: 董超

1.一種抗地西泮單鏈抗體的制備方法，其特征在于，至少包括以下步驟：

S1、構建scFv基因片段：設計抗地西泮抗體的VH基因片段和VL基因片段的核苷酸序列并進行人工合成，所述VH基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述VL基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，將所述VH基因片段與所述VL基因片段擴增后連接得到所述scFv基因片段；

S2、scFv-Fc抗體的表達：將所述scFv基因片段連入含有人IgG1 Fc的pFUSE_hIgG1e5_Fc2質粒中，構建得到pFUSE_hIgG1e5_Fc2-scFv重組質粒，轉染表達細胞，融和表達所述scFv-Fc抗體；

S3、純化：收集表達細胞的上清液，純化后，即得所述抗地西泮單鏈抗體。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，擴增VH基因片段的引物如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示，擴增VL基因片段的引物如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示；

通過SOE-PCR連接所述VH基因片段與所述VL基因片段，所述SOE-PCR所使用的引物序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8所示。

3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，在S2中，先將所述scFv基因片段擴增后再構建重組質粒，所述擴增的引物如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述表達細胞為FreeStyleTM 293F細胞。

5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述純化采用Protein A親和色譜進行純化。

6.如權利要求1～5任一項所述的制備方法制備得到的抗地西泮單鏈抗體。

7.一種地西泮的檢測方法，其特征在于，采用如權利要求6所述的抗地西泮單鏈抗體，利用ELISA法對待測樣本中的地西泮進行檢測。

8.根據權利要求7所述的檢測方法，其特征在于，采用競爭性抑制ELISA法。

9.根據權利要求7所述的檢測方法，其特征在于，至少包括以下步驟：

S1、包被：采用DZP-OVA包被原包被微孔板；

S2、封閉：洗滌后用BSA封閉非特異性結合位點；

S3、洗滌，加入所述抗地西泮單鏈抗體；

S4、用將DZP標準品稀釋成梯度濃度，加入微孔板，混合后孵育；

S5、洗滌，加入HRP標記的抗人IgG1抗體，孵育；

S6、顯色，測定吸光度值，繪制抗DZP scFv-Fv抗體的間接競爭ELISA標準曲線；

S7、待測樣本前處理，采用S1～S6的步驟測定吸光度值，通過所述間接競爭ELISA標準曲線獲得待測樣本的濃度。

10.根據權利要求9所述的檢測方法，其特征在于，在S1中，DZP-OVA包被原的濃度為2μg/mL。

11.根據權利要求9所述的檢測方法，其特征在于，

在S3中，所述抗地西泮單鏈抗體的稀釋倍數為1：3000。

12.根據權利要求9所述的檢測方法，其特征在于，在S4中，采用10％甲醇的PBS緩沖液稀釋DZP標準品。