[發明專利]一種用于肺癌早期診斷的外泌體ecDNA生物標志物檢測試劑及其用途

在審

• 申請號: 202011214402.3
• 申請日: 2020-11-04
• 公開（公告）號: CN112143814A
• 公開（公告）日: 2020-12-29
• 發明（設計）人: 馬躍;張亞楠
• 申請（專利權）人: 上海思路迪生物醫學科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京市蘭臺律師事務所 11354
• 代理人: 于越;張峰

1.一種用于肺癌早期診斷的外泌體ecDNA生物標志物檢測試劑，其特征在于，所述檢測試劑針對性檢測的生物標志物包括外泌體ecDNA生物標志物，所述外泌體ecDNA生物標志物為C-myc、EGFR和CyclinD1的組合。

2.如權利要求1所述的檢測試劑，其特征在于，所述C-myc、EGFR和CyclinD1的外泌體ecDNA組合生物標志物在肺癌患者的外泌體中的表達值與在對照樣本中的表達值相比具有統計學上的顯著差異。

3.如權利要求2所述的檢測試劑，其特征在于，所述對照樣本為非肺癌患者樣本。

4.一種用于肺癌早期診斷的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含有權利要求1至3任一項所述的檢測試劑。

5.一種使用權利要求1至3任一項所述檢測試劑在制備通過如下方法進行肺癌早期診斷的試劑盒中的用途，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

S1、采集疑似為肺癌患者的血液或體液樣本，分離并純化樣本中的外泌體；

S2、分離并純化外泌體中的ecDNA；

S3、對ecDNA生物標志物C-myc、EGFR和CyclinD1的組合進行表達檢測和關聯性分析。

6.如權利要求5所述的用途，其特征在于，所述步驟S1包括使用含有沉淀劑和洗滌劑A的沉淀法分離并純化樣本中的外泌體；所述沉淀劑包括終濃度為10％至60％的PEG10000；所述洗滌液A包括終濃度為0.1至30mmol/L的KH₂PO₄和終濃度為0.3-28mmol/L的Na₂H₂PO₄。

7.如權利要求6所述的用途，其特征在于，所述所述沉淀劑包括終濃度為15％的PEG10000；所述洗滌液A包括終濃度為1mmol/L的KH₂PO₄和終濃度為4mmol/L的Na₂H₂PO₄。

8.如權利要求5所述的用途，其特征在于，所述步驟S2包括使用含有裂解液、洗滌液B、洗滌液C、洗脫液、磁珠懸液、蛋白酶K、外切酶、ATP和EDTA的磁珠法分離并純化外泌體中的ecDNA；所述裂解液包括終濃度為1至5mol/L的異硫氰酸胍、終濃度為5至10mmol/L的檸檬酸鈉、終濃度為0.01至1g/ml的Polidocanol和體積百分比為5至45％的乙醇；所述洗滌液B包括終濃度為0.1至5mol/L的異硫氰酸胍、終濃度為50至100mmol/L的Tris-HCl、體積百分比為0.5％至5％的Tween-20和體積百分比為30至80％的乙醇；所述洗滌液C包括終濃度為0.1至5mol/L的NaCl和終濃度為1至20mmol/L的Tris-HCl；所述洗脫液為終濃度5至20mmol/L、pH為8.5的Tris-HCL；所述磁珠懸液包括終濃度為1至30mg/mL且直徑為300nm的硅羥基磁珠和體積百分比為10至50％的甘油；所述蛋白酶K包括終濃度為1至50mg/mL的Proteinase K和終濃度為10至50mmol/L的Tris-HCl；所述外切酶包含1至10units的核酸外切酶V。