[發(fā)明專利]黃酮3β-羥化酶還原酶突變體及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011213591.2
• 申請(qǐng)日: 2020-11-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112391360B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-09-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾偉主;周景文;高松;陳堅(jiān);堵國(guó)成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/00
• 分類號(hào): C12N9/00;C12N15/52;C12N15/81;C12N1/19;C12P17/06;C12R1/865
• 代理公司: 哈爾濱市陽(yáng)光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 彭素琴

本發(fā)明公開(kāi)了黃酮3β?羥化酶還原酶突變體及其應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)對(duì)黃酮3β?羥化酶還原酶進(jìn)行突變，獲得了能夠提高催化和生產(chǎn)性能的黃酮3β?羥化酶還原酶突變體，將得到的突變體在釀酒酵母中，協(xié)助黃酮3β?羥化酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化，能夠使得圣草酚含量較親本的805.6mg/L提高至980.9mg/L～1052.1mg/L，提高了21.8％～30.6％。因而本發(fā)明獲得的黃酮3β?羥化酶還原酶突變體具備廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及黃酮3β-羥化酶還原酶突變體及其應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

圣草酚(Eriodictyol)是一種重要的黃酮類化合物，因其所具備的抗炎、抗衰老、抗氧化等更能，而被廣泛應(yīng)用于食品添加劑。此外，多種高附加值化合物，如黃杉素、花青素、水飛薊及大風(fēng)子素等，都需要以圣草酚為前體物質(zhì)來(lái)合成。目前，對(duì)于圣草酚的制備，主要是依靠植物提取法，然而植物提取法有許多缺點(diǎn)，如需要高溫、提取時(shí)間長(zhǎng)、需要大量有機(jī)試劑等，提取過(guò)程需要消耗大量的能源，并且造成環(huán)境的污染，從而使得安全環(huán)保的微生物法展現(xiàn)出更大的優(yōu)勢(shì)。

根據(jù)目前的研究，可以將柚皮素經(jīng)F3′H催化，從而制備得到圣草酚。而F3′H在行使功能時(shí)，還需要還原酶CPR輔助獲得電子才具有催化功能，因此F3′H需要與CPR共表達(dá)才具有較好的催化功能。但目前對(duì)于F3′H以及還原酶CPR催化功能的研究還很少，即使是有被報(bào)道的，圣草酚產(chǎn)量也很低，如Amor等《Biotransformation of naringenin to eriodictyolby Saccharomyces cerevisiea functionally expressing flavonoid 3'hydroxylase》(公開(kāi)于2010年)中，利用F3′H催化柚皮素獲得圣草酚的最高產(chǎn)量?jī)H200mg/L。在Zhu等《Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli.》(公開(kāi)于2016年)中，公開(kāi)了在大腸桿菌中合成圣草酚的產(chǎn)量最高僅107mg/L。

由此可見(jiàn)，如何利用微生物實(shí)現(xiàn)圣草酚的高產(chǎn)仍然是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明中出發(fā)基因?yàn)閬?lái)源于水飛薊的黃酮3β-羥化酶的還原酶SmCPR，因?yàn)镾mCPR的結(jié)構(gòu)未知，通過(guò)理性改造進(jìn)一步提高SmCPR的酶活比較困難，為進(jìn)一步提高圣草酚的合成，可以利用定向進(jìn)化技術(shù)獲得酶活提高的SmCPR突變子，以及相應(yīng)的高產(chǎn)圣草酚菌株，這對(duì)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化微生物法生產(chǎn)圣草酚具有十分重要的意義。

本發(fā)明提供了黃酮3β-羥化酶還原酶突變體，所述突變體以氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的酶為親本，將親本第626和641位同時(shí)突變，或是將親本第453位的氨基酸突變。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，編碼親本的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述突變體是將親本第626位氨基酸突變?yōu)樘於０凡⒌?41位的氨基酸突變?yōu)樘於彼幔浒被嵝蛄腥鏢EQ ID NO.3所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述突變體是將親本的第453位突變?yōu)槔i氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本發(fā)明提供了編碼所述突變體的基因，所述突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，編碼基酸序列如SEQ ID NO.3所示的突變體的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，編碼基酸序列如SEQ ID NO.5所示的突變體的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本發(fā)明提供了攜帶所述基因的表達(dá)載體。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述表達(dá)載體以pY26-TEF-GPD為出發(fā)載體。