[發明專利]多肽標簽、高度可溶性的重組腈水解酶及其在醫藥化學品合成中的應用

有效

• 申請號: 202011211251.6
• 申請日: 2020-11-03
• 公開（公告）號: CN112358530B
• 公開（公告）日: 2021-10-15
• 發明（設計）人: 薛亞平;謝冬;熊能;鄭裕國
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C07K19/00;C12N9/78;C12N9/20;C12N9/80;C12N1/21;C12P13/00;C12P7/42;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發明公開了一種重組腈水解酶及其在醫藥化學品合成中的應用，所述重組腈水解酶是在腈水解酶氨基酸序列的N端連接多肽標簽；所述多肽標簽兩端位置均為不帶電的甘氨酸G，其余為甘氨酸G、組氨酸H、谷氨酸E、天冬氨酸D、賴氨酸K、精氨酸R中任意一種或多種的隨機組合。本發明重組腈水解酶制備1?氰基環己基乙酸時活力高達3034.7U/g dcw，多肽標簽的引入顯著提高了腈水解酶的可溶性表達，相同濃度全細胞催化劑水解1M底物時較母本酶快30min完成，且穩定性優于母本酶。本發明重組腈水解酶還能夠催化合成其它醫藥中間體，并提高反應中全細胞催化劑的活力，提高其它不同種類腈水解酶的可溶性，以及相應的全細胞催化劑的活力。

(一)技術領域

本發明涉及一種多肽標簽，特別涉及一種可增強腈水解酶等酶可溶性表達的通用多肽標簽，及在醫藥化學品合成中的應用，屬于基因工程以及蛋白質工程技術領域。

(二)背景技術

腈水解酶(EC 3.5.5.1)是一類重要的具有Glu-Lys-Cys催化活性中心三聯體的水解酶，可在一步反應中有選擇地且有效地催化氰基水解為羧基，在有機酸、氨基酸、維生素等化工產品和如加巴噴丁、氯吡格雷、巴氯芬、阿托伐他汀等醫藥化學品的合成中具有廣泛的應用。

迄今為止，已經報道了許多提高蛋白質可溶性表達水平的有效方法，一種是構建重組周質滲漏菌株或共表達周質伴侶蛋白，另一種是添加融合標簽(也稱為融合伴侶或溶解性標簽)進行協同表達。但這些方法或多或少的存在一些缺陷。如多肽標簽上氨基酸的選擇、序列的長度可能對重組酶的酶活，穩定性，溶解度或選擇性有很大副作用，某些標簽甚至會改變酶蛋白的結構導致酶完全失去活性。對于不同的酶的結構和蛋白整體在催化體系中的帶電屬性，不同的多肽標簽的引入會帶來不同的效果，需要結合動力學模擬、同源建模等技術進行協助標簽的設計。但是有效的多肽標簽的優點之一是和目的基因連接后表達并不需要去除即可發揮酶蛋白的作用。其中，Sun-Ki Kim開發了一種新的聚陰離子多肽標簽，顯著提高了南極假絲酵母脂肪酶的表達水平和細胞外轉運效率。此外，Han等人開發了一種新的融合標簽[HE-MBP(Pyr)]以提高重組蛋白在大腸桿菌中的溶解度，研究表明目的蛋白(如單克隆抗體，抗原蛋白和聚合蛋白)溶解度有不同程度的改善。

在生物合成方法中，涉及到生物催化的過程通常都是使用全細胞催化劑(濕細胞)來進行的。一般認為產酶發酵中發酵液的體積酶活為比酶活和可溶性表達水平兩者的結合。若能在不影響原始特性的前提下，提高酶的比酶活或有效蛋白質的數量將促進全細胞催化性能的進一步提高。所以，增加腈水解酶在大腸桿菌中的溶解度是有巨大意義的。然而增加大腸桿菌所產酶的溶解度是總是以犧牲活力為代價的。因此，在不降低催化水平的情況下合理地增加腈水解酶的溶解度是實現加巴噴丁中間體1-氰基環己基乙酸(1-CA)的高效生產仍需進一步研究。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種多肽標簽、含多肽標簽的重組酶及其在醫藥化學品合成中的應用，所述多肽標簽能夠使含多肽標簽的重組酶的全細胞催化劑活力和熱穩定性均得到有效提升。解決酶熱穩定性差，酶活不滿足工業大規模應用等問題。

本發明采用的技術方案是：

本發明提供一種多肽標簽，所述多肽標簽兩端的氨基酸均為不帶電的甘氨酸(G)，其余為甘氨酸(G)、組氨酸(H)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、賴氨酸(K)、精氨酸(R)中任意一種或多種的隨機組合；所述多肽標簽的長度為5－11個氨基酸。

進一步，所述多肽標簽氨基酸序列為下列之一：GKGKG、GKGEG、GKGHG、GRGRG、GRGGG、GHGHG、GDGDG、GDGEG、GDGRG、GDGKG、GEGEG、GEGKG、GEGGG、GEGRG、GEGDG、GKGKG、GKGDG、GKGEG、GKGGG、GKGHG、GKGRG、GRGRG、GRGDG、GRGEG、GRGKG、GRGGG、GGGKG、GGGEG、GHGHG、GKGKGKG、GKGKGKGKG、GKGKGKGKGKG。