[發明專利]多肽標簽、高度可溶性的重組腈水解酶及其在醫藥化學品合成中的應用

有效

• 申請號: 202011211251.6
• 申請日: 2020-11-03
• 公開（公告）號: CN112358530B
• 公開（公告）日: 2021-10-15
• 發明（設計）人: 薛亞平;謝冬;熊能;鄭裕國
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C07K19/00;C12N9/78;C12N9/20;C12N9/80;C12N1/21;C12P13/00;C12P7/42;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

1.一種含多肽標簽的重組酶，其特征在于所述重組酶是將多肽標簽連接至腈水解酶氨基酸序列的N端所得到的酶；所述多肽標簽的氨基酸序列為GKGKG。

2.如權利要求1所述含多肽標簽的重組酶，其特征在于所述腈水解酶的氨基酸序列為SEQ ID NO.1所示。

3.如權利要求2所述含多肽標簽的重組酶，其特征在于所述多肽標簽通過連接肽與腈水解酶氨基酸序列的N端連接，所述連接肽氨基酸序列為下列之一：GS、GGS。

4.一種含權利要求1所述多肽標簽的重組酶的編碼基因構建的重組基因工程菌。

5.一種含權利要求1所述多肽標簽的重組酶在制備加巴噴丁中間體1-氰基環已基乙酸中的應用，其特征在于所述的應用為：以含多肽標簽的重組腈水解酶的編碼基因的重組基因工程菌經發酵培養獲得的濕菌體或濕菌體純化后的純酶為催化劑，以1-氰基環己基乙腈為底物，以0.2M、pH＝7.0的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄緩沖液為反應介質構成轉化體系，35℃、200rpm恒溫水浴反應完全，獲得含1-氰基環己基乙酸的轉化液，轉化液分離純化，獲得1-氰基環己基乙酸；所述轉化體系中，底物加入終濃度為1-2M，催化劑加入量以濕菌體重量計為50g/L。

6.如權利要求5述的應用，其特征在于所述濕菌體按如下方法制備：將重組基因工程菌接種至LB培養基，37℃培養12-14h后，獲得單菌落；挑取單菌落接種到含0.5μg/mL卡那霉素的LB試管培養基中，37℃培養8h后，以體積濃度2％的接種量轉接至含0.5μg/mL卡那霉素的發酵培養基中，37℃培養2h后，加入終濃度0.1mM的IPTG，28℃誘導產酶12-14h，12,000rpm離心10min，沉淀用0.9％的生理鹽水清洗2次，收集濕菌體。

7.一種含權利要求1所述多肽標簽的重組酶在制備氯吡格雷中間體鄰氯扁桃酸中的應用，其特征在于所述的應用為：將含多肽標簽的重組腈水解酶的基因工程菌經發酵培養獲得的濕菌體為催化劑，以鄰氯扁桃腈為底物，以0.2M、pH7.0的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄緩沖液為反應介質構成反應體系，35℃恒溫水浴反應12h，獲得含鄰氯扁桃酸的反應液，分離純化，得到鄰氯扁桃酸；所述反應體系中，催化劑加入量以濕菌體重量計為50g/L，所述底物加入終濃度為1-2M。