[發明專利]一種表達Furin蛋白的細胞株及其在禽傳染性支氣管炎病毒培養中的應用

有效

• 申請號: 202011211170.6
• 申請日: 2020-11-03
• 公開（公告）號: CN112342244B
• 公開（公告）日: 2023-06-30
• 發明（設計）人: 廖瑛;丁鏟;王歡;孫英杰;譚磊;孟春春;宋翠萍;仇旭升;劉煒瑋
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院上海獸醫研究所(中國動物衛生與流行病學中心上海分中心)
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66;C12N15/65;C12N15/57;C12N5/10;C12N7/00;C12R1/93
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• 代理人: 鞏克棟

本發明提供了一種表達Furin蛋白的細胞株及其在禽傳染性支氣管炎病毒培養中的應用，所述表達Furin蛋白的細胞株為基因組中整合有雞源Furin基因的哺乳動物細胞，所述雞源Furin基因通過慢病毒導入哺乳動物細胞。本發明的表達Furin蛋白的細胞株可用于多株IBV的體外培養，克服了現有技術中大多數IBV毒株無法在哺乳動物細胞內生長的技術難題，簡化了病毒的擴繁過程，也消除了可能因感染其他禽類而帶來的生物隱患，在基礎研究及疫苗研發中具有廣泛的應用價值。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種表達Furin蛋白的細胞株及其在禽傳染性支氣管炎病毒培養中的應用。

背景技術

由禽傳染性支氣管炎病毒(Infectious?bronchitis?virus，IBV)引起的傳染性支氣管炎是一種禽類的急性、高度接觸性的流行性疾病，主要侵害禽類的呼吸、消化及泌尿生殖系統，給我國及世界養禽業造成了巨大的損失。

研究人員對IBV進行了系統深入的研究，他們采取了不同的方法來獲取數量足夠、活力較強的病毒。目前禽源病毒主要通過雞胚繁殖法及細胞培養法來制備。

李華偉等人(李華偉等，雞傳染性支氣管炎病毒M41型的擴繁及在雞胚腎細胞上的適應性研究[J].北京農學院學報，2011，26(3)：31-34.)通過向9-11日齡的SPF雞胚的尿囊腔中接種雞胚尿囊凍干毒，反復傳至第11代，獲得了帶有IBV的尿囊液，并證明10日齡雞胚的接種效果要好于9日齡及11日齡雞胚。雞胚繁殖法簡單易行，但是需要大量的雞胚，且在收獲病毒液后，需要對接種后的剩余雞胚進行無害化處理，處理不當可能會危害其他禽類，存在生物隱患。

雞胚腎細胞(CEK)也可用于IBV的擴繁。李廣興等人(李廣興等，膽固醇對雞傳染性支氣管炎病毒感染雞胚腎細胞的影響[J].東北農業大學學報，2017，48(4)：45-52.)制備了CEK細胞，并向單層CEK細胞接種IBV?M41病毒懸液，接種后的細胞均出現了細胞病變效應(CPE)，細胞變圓、固縮，隨后他們又通過RT-PCR法證明了IBV在CEK內發生了增殖。細胞培養有利于開展病毒的基礎性研究，然而，CEK細胞目前尚未實現連續傳代，原代細胞制備過程復雜，操作繁瑣，需要較高的操作水平，因而很少被應用于IBV的擴繁中。

目前，只有IBV-Beaudette毒株可以在Vero細胞系及部分人源細胞系中生長，這給IBV的研究帶來了困難。有研究人員通過對IBV進行改造，以實現其在哺乳動物細胞中的連續培養。CN106119207A公開了一個IBV改造毒株，通過No?See’M技術，將Vero細胞適應毒株Beaudette?P65株的S基因替換H120毒株的S基因，獲得了R-H120-Beaudette?P65(S)拯救毒株，實現了其在Vero細胞系中的適應生長。然而，對病毒進行改造必然會改變病毒的原有特性，獲得的實驗數據與實際數據有誤差，此外，若操作不當可能會使IBV的非天然宿主感染改造后的病毒。

禽傳染性支氣管炎病毒是當前影響我國及世界養禽業發展的主要病原之一，除Beaudette株外，其他IBV毒株難以在體外細胞系中傳代培養，這嚴重限制了該病毒感染與致病機制研究及新型疫苗的研發。如何通過現有的操作技術，實現大多數IBV毒株在傳代細胞上的連續培養，已成為目前亟待解決的問題。

發明內容

針對現有技術的不足和實際需求，本發明提供了一種表達Furin蛋白的細胞株及其在禽傳染性支氣管炎病毒培養中的應用，所述表達Furin蛋白的細胞株可供多株IBV毒株在其內進行復制，使病毒滴度增加，簡化了IBV的擴繁過程，降低了對研究人員的操作水平的要求，也排除了傳統的雞胚培養法可能造成的生物隱患。

為達此目的，本發明采用以下技術方案：

第一方面，本發明提供了一種重組載體，所述重組載體為含有雞源Furin基因的慢病毒載體。