[發明專利]一種表達Furin蛋白的細胞株及其在禽傳染性支氣管炎病毒培養中的應用

有效

• 申請號: 202011211170.6
• 申請日: 2020-11-03
• 公開（公告）號: CN112342244B
• 公開（公告）日: 2023-06-30
• 發明（設計）人: 廖瑛;丁鏟;王歡;孫英杰;譚磊;孟春春;宋翠萍;仇旭升;劉煒瑋
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院上海獸醫研究所(中國動物衛生與流行病學中心上海分中心)
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66;C12N15/65;C12N15/57;C12N5/10;C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

1.重組載體、重組慢病毒或表達Furin蛋白的細胞株在培養禽傳染性支氣管炎病毒中的應用；

所述重組載體為含有雞源Furin基因的慢病毒載體；

所述雞源Furin基因為SEQ?ID?NO:?1所示的核酸序列；

所述重組慢病毒由所述重組載體和輔助質粒共轉染哺乳動物細胞包裝得到；

所述表達Furin蛋白的細胞株含所述重組載體或所述重組慢病毒；

所述禽傳染性支氣管炎病毒為IBV-H120株、IBV-4/91株、IBV-QX株或IBV-M41株中的任意一種或至少兩種的組合；

所述表達Furin蛋白的細胞株為基因組中整合有SEQ?ID?NO:?1所示的核酸序列的Vero細胞系。

2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述哺乳動物細胞包括293T細胞。

3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述重組載體為連接有SEQ?ID?NO:?1所示的核酸序列的Phage-puro載體。

4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述表達Furin蛋白的細胞株的構建方法包括：

構建重組載體，采用所述重組載體與輔助質粒共轉染哺乳動物細胞，構建重組慢病毒；

采用所述重組慢病毒感染宿主細胞，嘌呤霉素篩選得到所述表達Furin蛋白的細胞株。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述重組載體的構建方法包括：

采用SEQ?ID?NO:?2~3所示的引物對PCR擴增雞成纖維細胞系cDNA，獲得雞源Furin基因；

將所述雞源Furin基因連接入線性化慢病毒載體中，轉化感受態細胞，經抗性、測序篩選后得到所述重組載體。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述雞源Furin基因插入慢病毒載體的NotI和Xba?I酶切位點之間。

7.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述宿主細胞包括Vero細胞系。

8.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述篩選時嘌呤霉素的濃度為0.1~1?μg/mL。

9.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述篩選的時間不短于48?h。

10.一種禽傳染性支氣管炎病毒的培養方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

（1）培養權利要求1中所述的表達Furin蛋白的細胞；

（2）將禽傳染性支氣管炎病毒接種于所述表達Furin蛋白的細胞中，共培養；

（3）去除未吸附的禽傳染性支氣管炎病毒粒子，更換培養基繼續培養，收集細胞上清液；

所述禽傳染性支氣管炎病毒為IBV-H120株、IBV-4/91株、IBV-QX株或IBV-M41株中的任意一種或至少兩種的組合；

所述表達Furin蛋白的細胞為基因組中整合有SEQ?ID?NO:?1所示的核酸序列的Vero細胞系。

11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，步驟（1）所述培養的溫度為35~40℃。

12.根據權利要求11所述的方法，其特征在于，步驟（1）所述培養的溫度為37℃。

13.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，步驟（1）所述培養的CO₂濃度為4.5%~5.5%。

14.根據權利要求13所述的方法，其特征在于，步驟（1）所述培養的CO₂濃度為5%。

15.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，步驟（1）所述表達Furin蛋白的細胞培養至豐度不低于90%。