[發明專利]結直腸癌類器官的培養方法和培養液

有效

• 申請號: 202011211090.0
• 申請日: 2020-11-03
• 公開（公告）號: CN112266898B
• 公開（公告）日: 2023-02-24
• 發明（設計）人: 王均;甘麗琴;陳安娜;沈松;陳轉鵬;梁潔;唐世帆
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 廣州廣典知識產權代理事務所(普通合伙) 44365
• 代理人: 萬志香

本發明涉及了一種結直腸癌類器官的培養方法和培養液。本發明的培養基用自產Wnt?3a、R?Spondin1和Noggin的細胞系替代三種昂貴細胞因子的加入，對比文獻中類器官培養基配方最大限度地節約了類器官培養的成本，且成功率達到90％以上。本發明的培養液，能夠培養來源于患者結直腸來源的腫瘤組織。所述培養方法操作簡便，五天即可傳代，五天之內可不用頻繁換液，也減少了操作的繁瑣和節約了成本。

技術領域

本發明屬于生物基因工程領域，具體地涉及一種結直腸癌類器官的培養方法和培養液。

背景技術

癌癥治療的主要挑戰是確定一種局部疾病是否會發展成惡性表型，以及如何根據疾病的類型和階段進行最佳的“匹配”治療。現在人們普遍認為，對于許多癌癥來說，它們不再是一種單一類型的疾病，而是一組癌癥類型，根據組織學病理分類，對藥物的反應不同。多年來，基礎癌癥研究和抗癌藥物開發利用原代癌細胞和體外培養的細胞系在組織培養皿中培養。雖然這種方法產生了許多目前使用的抗癌藥物，但最近的研究發現，這種方法在體內模擬腫瘤生長效果不佳。在大多數情況下，二維(2D)培養,就像在培養皿中進行的培養，無法復制腫瘤的微環境：一個由基質細胞、細胞外基質(ECM)成分，和一個混合信號因子組成的復雜的空間，藥物擴散動力學差異很大，2D有效的藥物劑量對患者來說通常是無效的，細胞-細胞/細胞-基質的相互作用是不準確的。培養皿的細胞與分離腫瘤的組織有三個主要區別：表面形貌、表面硬度和2D而非3D的結構。因此，2D培養對細胞施加了選擇性壓力，這可能極大地改變細胞的分子和表型特性。實驗室細胞培養和天然組織之間的這些差異導致許多藥物在實驗室最初有效，但在病人身上測試時卻出乎意料地無效和/或有毒。

因此，為了在生理上提供一種比2D細胞培養更相關的選擇，三維(3D)細胞培養被開發出來。通過考慮至關重要的細胞-細胞和細胞-ECM相互作用，3D培養允許細胞復制組織中存在的幾個關鍵特征，包括形態、分化、極性，增殖率，基因表達譜和基因組譜，和腫瘤細胞異質性和營養和氧梯度。重要的是，3D細胞培養跨越了2D細胞培養和動物模型之間的鴻溝：3D細胞培養模型包含了生理上相關的相互作用，同時仍然能夠方便地進行遺傳操作、生化分析和成像。通過提供一個可復制的、可控的微環境來模擬體內條件，3D細胞培養已經成為一種有效的替代動物模型的方法。此外，由于能夠創建三維設計微環境，3D細胞培養可以研究有機生命體中難以解決的問題。

自20世紀70年代首次以漂浮膠原凝膠的形式被使用以來，3D細胞培養系統已經有了很大的發展，目前仍在發展和改進中，其最終目標是在培養中再造整個器官。許多科學界的科學家已經貢獻了工具和技術，如生物工程材料、納米技術、微流體和3D生物打印，以在多個層次和尺度上精確地操縱和控制細胞微環境(其化學、幾何和力學)。這些進展導致了無數的三維細胞培養系統的創造，這些系統主要是根據科學家的特殊需要而研發設計的。

結直腸癌是目前世界上癌癥引發死亡的主要因素之一。據已有的報道發現，結直腸癌是全球第三大最常見的惡性腫瘤，預計到2030年，結直腸癌新增病例將超過220萬，癌癥死亡人數將達到110萬。大約有20％的結腸癌病人在診斷時已為晚期，失去手術機會，導致結直腸癌患者死亡的主要原因是遠端轉移。目前阻礙臨床轉化的問題是許多癌癥模型不能很好地重現患者腫瘤的異質性，導致各種化療藥、小分子抑制劑或者靶向藥最終在臨床實驗中以失敗告終。導致失敗的主要原因是目前普遍使用的腫瘤細胞系模型和異種移植動物模型所存在的不足，例如，單層細胞培養缺乏多樣化的細胞類型、空間組織性和體內整體微環境，無法模擬個體間的腫瘤異質性，而動物模型雖然能在一定程度上模擬體內的情形，且能反映各系統間的相互作用，但移植成功率低、培養周期長和成本高等缺點使其難以應用于臨床。由此，兼具兩者優勢的類器官研究近年來成為一個新的研究熱點。

類器官是由多種器官特異性細胞類型組成的三維培養體，可以重現其結構和基因表達譜，以及相應器官的一些關鍵特征和功能。類器官技術被評為2017年生命科學領域的年度技術。目前這項技術由于成本高，操作復雜和技術難度大和而并沒有普及使用。因此，有需要開發一種低成本，簡便并且成功率可低溫冷藏的體外類器官培養方法。

發明內容