[發明專利]結直腸癌類器官的培養方法和培養液

有效

• 申請號: 202011211090.0
• 申請日: 2020-11-03
• 公開（公告）號: CN112266898B
• 公開（公告）日: 2023-02-24
• 發明（設計）人: 王均;甘麗琴;陳安娜;沈松;陳轉鵬;梁潔;唐世帆
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 廣州廣典知識產權代理事務所(普通合伙) 44365
• 代理人: 萬志香

1.一種結直腸癌類器官的培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

樣本的取樣和預處理：在結直腸癌患者手術樣本的邊緣突起實質部分剪切組織，低溫培養基保存送至實驗室，清洗干凈；

結直腸癌單細胞的分離：清洗干凈后的組織剪切至無可見顆粒為止，按10mL/1g加入酶消化液進行消化，至消化液里大量顆粒沉淀變為絮狀物為止； 過濾獲得細胞，加入類器官培養液，得到細胞混懸液；

結直腸癌組織消化后細胞體外培養：將細胞混懸液和基質膠按照體積比為1：1.8-2.2混合，得混合物，每40ul混合物中含有結直腸癌單細胞2~3萬個；然后所述混合物接種于六孔板中，培養4-6天后進行傳代；

所述類器官培養液包括含有占總體積的45-55%的產Wnt-3a、 R-Spondin1和 Noggin的WRN細胞系條件培養基、以及50±5ng/mL EGF、500±5nM A8301、10±5μM SB202190、10±1μM Y-27632、1±0.25mM N-acetylcysteine、10±1nM Gastrin、1XB27、10±1mMNicotinamide、2±0.1mM Glutamax、1±0.1mM HEPES的Advanced DMEM/F12培養液。

2.根據權利要求1所述的結直腸癌類器官的培養方法，其特征在于，所述類器官培養液還包括青霉素和鏈霉素，所述青霉素和鏈霉素的總濃度為100±5 U/mL。

3.根據權利要求1所述的結直腸癌類器官的培養方法，其特征在于，所述產Wnt-3a、 R-Spondin1和 Noggin 的WRN細胞系條件培養基的制備方法包括：

解凍低代數的L-WRN細胞，在DMEM培養基中培養22-26h，然后換成加入G418和hygromycin的常規培養基至交匯；

在37℃ TE消化3-5分鐘，用常規培養基重懸，傳代比率為1：4-1：6；

培養3-4天后至交匯后，將常規培養基換成原代培養基；培養22-26h后，離心收集上清；用同等體積的原代培養基繼續培養，每隔22-26h，收集上清，培養三至五次，匯總全部上清，然后加入等體積的原代培養基，即得。

4.根據權利要求1所述的結直腸癌類器官的培養方法，其特征在于，所述培養于37℃培養箱中，固化后加入新鮮配制的結直腸癌類器官培養液，繼續培養。

5.根據權利要求1所述的結直腸癌類器官的培養方法，其特征在于，按照1：4-1：6的傳代比率進行傳代，傳代后可穩定生長，且在傳代前不需要再次更換新鮮的培養基。

6.根據權利要求1所述的結直腸癌類器官的培養方法，其特征在于，所述酶消化液為含1±0.1mg/mL的膠原酶Ⅳ、100±5μg/mL的DNA酶、100±5μg/mL的透明質酸酶和10±1μM的Y-27632。

7.根據權利要求1所述的結直腸癌類器官的培養方法，其特征在于，剪切組織為0.4g-1g；和/或所述酶消化液的用量為每1g組織加入8-12ml。

8.根據權利要求1所述的結直腸癌類器官的培養方法，其特征在于，剪切組織為0.45g-0.55g。

9.根據權利要求1所述的結直腸癌類器官的培養方法，其特征在于，細胞混懸液和基質膠按照體積比為1：2混合。