[發明專利]一種定量蒿屬植物花粉中nsLTP過敏原的方法

有效

• 申請號: 202011210352.1
• 申請日: 2020-11-03
• 公開（公告）號: CN112710837B
• 公開（公告）日: 2022-05-17
• 發明（設計）人: 高中山;趙嵐;高畢遠;付婉藝
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/543;G01N33/58
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 沈金龍

本發明公開了一種定量蒿屬植物花粉中nsLTP過敏原的方法，使用雙單抗夾心酶聯免疫吸附實驗進行定量，其中結合一抗為A2?B8單抗，來自杭州艾樂吉生物科技有限公司，貨號MA?A2B8；檢測二抗為A9?G10單抗，來自杭州艾樂吉生物科技有限公司，貨號MA?A9G10。本發明一種定量蒿屬植物花粉中nsLTP過敏原的方法具有較高的靈敏性和特異性，能夠定量常見蒿屬花粉中Artv 3類型過敏原。

技術領域

本發明涉及生物技術檢測技術領域，特別是涉及一種定量蒿屬植物花粉中nsLTP過敏原的方法。

背景技術

蒿屬植物花粉是造成夏秋季節過敏性疾病的主要致敏原之一，據統計，在我國有11.3％的呼吸道過敏性疾病患者對蒿屬花粉過敏，北方地區尤為嚴重(超過50％)。我國蒿屬植物分布廣泛，種類繁多，其中黃花蒿(Artemisia annua)、艾蒿(A.argyi)、大籽蒿(A.sieversiana)、茵陳蒿(A.capillaris)、野艾蒿(A.lavandulifolia)最為常見，目前用于體外診斷和免疫治療的花粉提取物主要來自大籽蒿。

已經鑒定到的蒿花粉過敏原共7種，按照國際免疫學會聯合會(I.U.I.S)下屬的過敏原命名專門委員會(Allergen Nomenclature Sub-committee)(http://www.allergen.org)制定的過敏原命名規則，依次命名為Art v 1-6(來源于A.vulgaris)以及來源于黃花蒿(A.annua)的Art an 7。其中第一組分(Art v 1)和第三組分(Art v 3)是主要過敏原，Art v 1屬于類防御素蛋白，被視為蒿花粉過敏的標志過敏原，超過80％的蒿過敏患者對其敏感。Art v 3屬于病程相關蛋白第14家族中的非特異性脂質轉移蛋白(nsLTP)，分子量大小為9KDa，主要分布在花粉壁上，在歐洲，約有70％的蒿花粉過敏患者對其敏感，而我國約有25％-66％的患者對其敏感，這種蛋白作為泛過敏原存在于很多種植物中，能夠引起廣泛的交叉過敏反應，尤其是與薔薇科水果之間，誘發呼吸道、胃腸道、口腔等的過敏癥狀，嚴重影響患者的生活質量。

目前用于臨床診斷和脫敏治療的制劑主要是花粉提取物，而這些提取物由于種類和批次不同，其中所包含的過敏原有效成分差異很大，有些重要的過敏原在提取物中含量很低，用于診療中常出現漏檢或脫敏治療效果不顯著等問題，因此，為了提高臨床診療效率，對提取物中的主要過敏原進行定量是非常重要的。用于過敏原定量的方法包括酶聯免疫吸附法(ELISA)，質譜以及其他的分子生物學手段如PCR等，其中雙夾心酶聯免疫吸附實驗是最常用的過敏原定量方法，尤其在檢測微量過敏原方面有很高的應用價值，現在已經開發出很多可以用于單一過敏原組分定量的檢測試劑盒，如丹麥ALK公司開發的用于Art v1定量的單抗和多抗組合的酶聯免疫(ELISA)檢測試劑，桃果實中的nsLTP過敏原(Pru p 3)檢測試劑等。

發明內容

本發明提供一種用于蒿花粉中Art v 3(nsLTP)類型過敏原定量的方法，該方法具有較高的靈敏性和特異性，能夠定量常見蒿屬花粉中Art v 3類型過敏原。

利用雙單抗夾心酶聯免疫吸附實驗對我國主要的蒿屬花粉提取物(黃花蒿、艾蒿、茵陳蒿、大籽蒿、野艾蒿、細裂葉蓮蒿(A.gmelinii))中的nsLTP過敏原進行定量。

本發明包含以黃花蒿和艾蒿花粉提取物免疫小鼠，生產并篩選蒿花粉Art v 3類型過敏原的特異性單克隆抗體4種(A11-B2，A9-G10，5-E10，A2-B8)，對4種單抗的亞型和效價進行檢測，然后用這4種單抗進行結合實驗，篩選出與各種蒿親和力較強的單抗(A2-B8和A9-G10)，并用這些單抗進行進一步的配對實驗，篩選出用于雙夾心酶聯免疫吸附實驗(ELISA)的最適濃度。4種單抗都來源于杭州艾樂吉生物科技有限公司，其中A11-B2單抗的貨號為MA-A11B2，A9-G10單抗的貨號為MA-A9G10，5-E10單抗的貨號為MA-5E10，A2-B8單抗的貨號為MA-A2B8。