[發(fā)明專利]一種臍帶血CIK細胞的擴增培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011209454.1
• 申請日: 2020-11-03
• 公開（公告）號: CN112251407A
• 公開（公告）日: 2021-01-22
• 發(fā)明（設計）人: 陳海佳;王小燕;簡毅超;張夢晨
• 申請（專利權）人: 廣州康琪萊精準醫(yī)療科技有限公司;廣州賽萊拉生物基因工程有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 蘇云輝

本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)技術領域，尤其涉及一種臍帶血CIK細胞的擴增培養(yǎng)方法。本發(fā)明公開了一種臍帶血CIK細胞的擴增培養(yǎng)方法，首次將細胞培養(yǎng)袋應用于臍帶血分離的CIK細胞誘導培養(yǎng)，由于細胞培養(yǎng)袋具有培養(yǎng)介質體積大，氣體交換面積大的優(yōu)點，可以在培養(yǎng)過程中將臍帶血單個核細胞混雜的紅細胞稀釋，促進其自身快速代謝去除，避免紅細胞混雜對培養(yǎng)效果影響，從而提高CIK細胞的純度。細胞培養(yǎng)袋操作簡便，同樣達到短時間內CIK細胞快速活化擴增的目的。

技術領域

本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)技術領域，尤其涉及一種臍帶血CIK細胞的擴增培養(yǎng)方法。

背景技術

CIK細胞本身就是人體內的一群異質細胞，具有高效殺傷感染、病變細胞的能力，只是在體質虛弱、亞健康人群中的CIK細胞由于生理方面的原因沒有被激活，而CIK細胞經(jīng)過體外激活擴增回輸?shù)襟w內后，CIK細胞會迅速活化攻擊清除異常細胞。

當前臍帶血主要根據(jù)細胞密度差異，借助離心產生的重力加速度，進行細胞的分離純化進行血細胞分離。由于臍血與成人外周血相比，有核細胞數(shù)目多，富含造血干細胞，且臍血中紅細胞體積較大，密度偏小。而常見淋巴細胞分離液密度介于1.075～1.090之間，主要適用于外周血分離，采用該方法應用到臍帶血單個核細胞分離時會出現(xiàn)紅細胞混雜，分層不明顯的問題，干擾CIK細胞培養(yǎng)的效果。

發(fā)明內容

本發(fā)明提供了一種臍帶血CIK細胞的擴增培養(yǎng)方法，解決了采用常規(guī)密度梯度離心方法分離臍帶血單個核細胞分離會出現(xiàn)紅細胞混雜，干擾CIK細胞培養(yǎng)的問題。

其具體技術方案如下：

本發(fā)明提供了一種臍帶血CIK細胞的擴增培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

步驟1：第0天，將臍帶血單個核細胞接種于含IFN-γ和基礎培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)袋進行培養(yǎng)；

步驟2：培養(yǎng)至第24h～26h后，加入OKT-3、IL-1α和IL-2繼續(xù)培養(yǎng)；

步驟3：每天觀測細胞培養(yǎng)狀態(tài)，每隔2～3天進行細胞計數(shù)，若細胞出現(xiàn)增殖，補加IL-2和基礎培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，若細胞未出現(xiàn)增殖，于第4天補加IL-2；

步驟4：步驟3第一次補液后，每隔2～3天補加IL-2和基礎培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至14～21天，收獲臍帶血CIK細胞。

IFN-γ：Ⅱ型干擾素，又稱IFN-γ或免疫干擾素是由有絲分裂原刺激T淋巴細胞產生。干擾素是一種高效的抗病毒生物活性物質，又是一種具有廣泛免疫調節(jié)作用的淋巴因子。

OKT-3：CD3單克隆抗體(OKT3)能針對CD3分子的單克隆抗體能夠激發(fā)或阻斷T細胞活化信號轉導，清除效應T細胞或誘導調節(jié)T細胞的產生。具有激活T細胞增殖及活化作用。

IL-1α：白細胞介素-1，可使CD4+T細胞活化，促進B細胞生長和分化與IL-2或干擾素協(xié)同可以增強NK細胞活性。

IL-2：又稱白細胞介素-2，是趨化因子家族的一種細胞因子。具有活化T細胞產生增殖，促進淋巴細胞生長、增殖、分化的多向性作用的細胞因子。

本發(fā)明中，細胞培養(yǎng)袋具有培養(yǎng)介質體積大，氣體交換面積大的優(yōu)點，可以在培養(yǎng)過程中將臍帶血單個核細胞混雜的紅細胞稀釋，促進其自身快速代謝去除，避免紅細胞混雜對培養(yǎng)效果影響，從而提高CIK細胞的純度。本發(fā)明采用細胞培養(yǎng)袋進行培養(yǎng)，省去培養(yǎng)容器的蛋白包被的步驟，細胞培養(yǎng)袋操作簡便，同樣達到短時間(14d～21d)內CIK細胞快速活化擴增的目的。

本發(fā)明步驟1中，臍血單個核細胞的分離包括以下步驟：

將稀釋后的臍血加入淋巴細胞分離液，800g離心30min，吸取白膜層進行重懸，600g離心10min，得到臍帶血單個核細胞；