[發(fā)明專利]一種臍帶血CIK細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011209454.1
• 申請日: 2020-11-03
• 公開（公告）號: CN112251407A
• 公開（公告）日: 2021-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳海佳;王小燕;簡毅超;張夢晨
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州康琪萊精準(zhǔn)醫(yī)療科技有限公司;廣州賽萊拉生物基因工程有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 蘇云輝

1.一種臍帶血CIK細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1：第0天，將臍帶血單個核細(xì)胞接種于含IFN-γ和基礎(chǔ)培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)袋進(jìn)行培養(yǎng)；

步驟2：培養(yǎng)至第24h～26h后，加入OKT-3、IL-1α和IL-2繼續(xù)培養(yǎng)；

步驟3：每天觀測細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)，每隔2～3天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，若細(xì)胞出現(xiàn)增殖，補(bǔ)加IL-2和基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，若細(xì)胞未出現(xiàn)增殖，于第4天補(bǔ)加IL-2；

步驟4：步驟3第一次補(bǔ)液后，每隔2～3天補(bǔ)加IL-2和基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至14～21天，收獲臍帶血CIK細(xì)胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，所述臍帶血單個核細(xì)胞的接種量為1.5-3.0×10⁶個/mL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟1所述IFN-γ在培養(yǎng)體系的終濃度為500-1500U/mL；

步驟2所述OKT-3、所述IL-1α和所述IL-2在培養(yǎng)體系的終濃度分別為30-70ng/mL、80-120U/mL、150-500U/mL；

步驟4所述IL-2在培養(yǎng)體系的終濃度為250-800U/mL。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為含胎牛血清的無血清培養(yǎng)基；

所述無血清培養(yǎng)基選自GT-T551培養(yǎng)基、DWK培養(yǎng)基、Lonza培養(yǎng)基或X-VIVO 15培養(yǎng)基。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟2中，OKT-3、IL-1α和IL-2同時在培養(yǎng)至24h、24.5h、25h、25.5h或26h內(nèi)加入。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，所述胎牛血清在步驟1、步驟2、步驟3和步驟4培養(yǎng)體系的終濃度為2-8vol％。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟3具體為：培養(yǎng)至第3～4天，若細(xì)胞增殖，補(bǔ)加IL-2和基礎(chǔ)培養(yǎng)基，若細(xì)胞未增殖，于培養(yǎng)的第4天補(bǔ)加IL-2。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，若細(xì)胞增殖，補(bǔ)加IL-2在培養(yǎng)體系的終濃度為200-600U/mL；

若細(xì)胞未增殖，補(bǔ)加的IL-2在培養(yǎng)體系的終濃度為300-800U/mL。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟1前，還包括：臍帶血單個核細(xì)胞的分離；

所述分離具體包括以下步驟：

將稀釋后的臍血加入淋巴細(xì)胞分離液，800g離心30min，吸取白膜層進(jìn)行重懸，600g離心10min，得到臍帶血單個核細(xì)胞。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，培養(yǎng)過程中，維持細(xì)胞密度在2.0-4.5×10⁶個/mL。