[發明專利]一種共表達磷脂酶促進蛋白在枯草芽孢桿菌中胞外表達的方法

有效

• 申請號: 202011209142.0
• 申請日: 2020-11-03
• 公開（公告）號: CN112322602B
• 公開（公告）日: 2022-05-10
• 發明（設計）人: 吳敬;宿玲恰;黃燕
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;C12N9/16;C12N1/21;C12N15/75;C12N9/10;C12N9/90;C12R1/125
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了一種共表達磷脂酶促進蛋白在枯草芽孢桿菌中胞外表達的方法，屬于生物工程、酶工程、微生物工程技術領域。本發明將磷脂酶和目標蛋白在枯草芽孢桿菌中共表達，可實現胞內定位目標蛋白胞外表達，可以使海藻糖合酶的胞外分泌量達到5.8～6.2U/mL，并使分支酶的胞外分泌量達到456～580U/mL，提高生產效率、簡化后提取工藝，為規模化生產目的蛋白提供了應用基礎，具有較高的學術意義和應用價值。

技術領域

本發明涉及一種共表達磷脂酶促進蛋白在枯草芽孢桿菌中胞外表達的方法，屬于基因工程、酶工程、微生物工程技術領域。

背景技術

枯草芽孢桿菌屬于革蘭氏陽性菌，具備無致病性，環境兼容性好、不易產生抗藥性等優點，而且還具有良好的發酵基礎，其培養簡單快速，已被美國食品藥物管理局和中國相關部門認定為食品安全級菌株GRAS(Generally recognized as safe)，目前廣泛用于生產各種工業用酶。

胞外表達可簡化下游純化工藝，節約成本，因此在大規模工業化生產中具有絕對優勢。而對于天然胞內定位型蛋白通常只能在細胞內進行表達并且需要利用物理或化學方法對細胞進行破碎才能獲得目的蛋白，后續提取工藝不但繁瑣而且成本較高，因此尋找能夠有效的簡化下游提取步驟降低產物純化成本成為了研究者的目標。

我們前期研究發現，當Bacillus cereus來源的磷脂酶C在大腸桿菌中重組表達時，能夠在一定程度水解細胞膜的磷脂成分，增加細胞膜的通透性，保證細胞完整性的情況下使胞內蛋白分泌到胞外。但該酶促進胞外分泌的作用并非對任何酶都有作用，對異淀粉酶等分子量較大的酶促進分泌的作用不明顯。另一方面，當將該技術應用于枯草芽孢桿菌表達系統時，即重組蛋白與Bacillus cereus來源的磷脂酶C在枯草芽孢桿菌中共表達時，目的蛋白的胞外分泌效果不佳，因此，有必要將更適合于枯草芽孢桿菌宿主菌的磷脂酶與目標蛋白共表達，以實現目標蛋白的胞外制備。

發明內容

本發明的第一個目的是提供磷脂酶在促進枯草芽孢桿菌胞內蛋白向胞外分泌方面的應用；所述磷脂酶為(a)或(b)：

(a)含有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的磷脂酶；

(b)在(a)的基礎上進行了一個或多個氨基酸位點取代、缺失或添加的具有磷脂酶功能的由(a)衍生的蛋白質。

在一種實施方式中，所述磷脂酶與胞內蛋白共表達。

在一種實施方式中，所述胞內蛋白是不被運輸至細胞膜外的酶，包括但不限于海藻糖合酶、分支酶、木糖異構酶或4,6-α-葡萄糖基轉移酶。

在一種實施方式中，所述海藻糖合酶含有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，所述分支酶含有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；所述木糖異構酶含有SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；所述4,6-α-葡萄糖基轉移酶含有SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。

本發明的第二個目的是提供一種重組枯草芽孢桿菌，能夠在胞外表達海藻糖合酶、分支酶、木糖異構酶或4,6-α-葡萄糖基轉移酶。

在一種實施方式中，所述重組枯草芽孢桿菌是共表達磷脂酶與海藻糖合酶。

在一種實施方式中，所述重組枯草芽孢桿菌是共表達磷脂酶與分支酶。

在一種實施方式中，所述重組枯草芽孢桿菌是共表達磷脂酶與木糖異構酶。

在一種實施方式中，所述重組枯草芽孢桿菌是共表達磷脂酶與4,6-α-葡萄糖基轉移酶。

在一種實施方式中，所述磷脂酶來源于褐色嗜熱裂孢菌(Thermobifida fusca)，含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。