[發(fā)明專利]以木質(zhì)素衍生物生產(chǎn)粘康酸的工程菌構(gòu)建方法及其應(yīng)用

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• 申請日: 2020-11-03
• 公開（公告）號: CN112430616A
• 公開（公告）日: 2021-03-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁吉鋒
• 申請（專利權(quán)）人: 廈門大學(xué)
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/60;C12N15/53;C12N1/21;C12P7/44;C12R1/19
• 代理公司: 廈門創(chuàng)象知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 35232
• 代理人: 王鳳玲;尤懷成

本發(fā)明涉及一種以木質(zhì)素衍生物生產(chǎn)粘康酸的工程菌構(gòu)建方法及其應(yīng)用，該方法包括：向大腸桿菌中轉(zhuǎn)化含有香蘭酸去甲基化酶基因VanAB的重組質(zhì)粒以及含有脫羧酶基因GDC和兒茶酚雙加氧酶基因CatA的重組質(zhì)粒。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，該方法獲得的工程菌桿菌可使50mM木質(zhì)素衍生香蘭酸以高達(dá)87％以上的轉(zhuǎn)化效率生產(chǎn)粘康酸，具有廣闊的工業(yè)化應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以木質(zhì)素衍生物高效生產(chǎn)粘康酸的工程菌構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

己二酸是一種重要的化工前體原料，可以用于尼龍-6，6合成。目前工業(yè)使用的己二酸通常來源于石油基原料，其面臨著不可再生且產(chǎn)生三廢等問題。微生物法生產(chǎn)己二酸通常通過粘康酸為中間體，通過氫化還原而獲得，具有可再生、環(huán)境污染少等特點(diǎn)。目前報(bào)道的微生物合成法生產(chǎn)粘康酸通常采用發(fā)酵的方式。比如，Karen M.Draths等人報(bào)道利用大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)粘康酸，可以實(shí)現(xiàn)利用56mM葡萄糖作為底物生產(chǎn)16.8mM粘康酸；在分配補(bǔ)料的條件下，可以達(dá)到6.8g/L粘康酸。近期，通過大腸桿菌共培養(yǎng)策略，粘康酸的得率甚至達(dá)到了0.35g/g葡萄糖/木糖。此外，相關(guān)研究也陸續(xù)報(bào)道利用Pseudomonas putida,Saccharomyces cerevisiae以及Corynebacterium glutamicum等宿主生產(chǎn)粘康酸。此外，生物催化方面報(bào)道的最高粘康酸產(chǎn)量是以兒茶酚為原料，通過進(jìn)一步生物催化而獲得，達(dá)到了約100％的摩爾得率；但是兒茶酚被認(rèn)為是屬于致癌物，直接作為原料使用不利于操作。

木質(zhì)素作為地球上最豐富的芳香族原料，其中造紙業(yè)等生物煉制行業(yè)每年約產(chǎn)生1億噸木質(zhì)素廢棄物。通過化學(xué)手段或酶法分解，木質(zhì)素可以分解為多種芳香族化合物單體，可以作為可再生芳香族原料用于合成高附加值產(chǎn)品。例如：香蘭酸可以通過copper-vanadium hydrotalcite以及V(acac)₃/Cu(NO₃)₂·3H₂O催化分解木質(zhì)素而獲得。以木質(zhì)素衍生的香蘭酸作為底物，通過生物催化生產(chǎn)粘康酸的尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明提出了一種以木質(zhì)素衍生物生產(chǎn)粘康酸的工程菌構(gòu)建方法及其應(yīng)用。該方法構(gòu)建出的工程菌可使香蘭酸以高達(dá)87％以上的轉(zhuǎn)化效率生產(chǎn)粘康酸，具有較好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及工業(yè)化應(yīng)用前景。

為此，在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提出了一種以木質(zhì)素衍生物生產(chǎn)粘康酸的工程菌構(gòu)建方法，其包括以下步驟：

向大腸桿菌中轉(zhuǎn)化含有香蘭酸去甲基化酶基因VanAB的重組質(zhì)粒以及含有脫羧酶基因GDC和兒茶酚雙加氧酶基因CatA的重組質(zhì)粒。。

根據(jù)本發(fā)明的一種以木質(zhì)素衍生物生產(chǎn)粘康酸的工程菌構(gòu)建方法，該方法構(gòu)建的工程菌表達(dá)三種酶：來自惡臭假單胞桿菌Pseudomonas putida的香蘭酸去甲基化酶(vanillic acid O-demethylase,VanAB)、來自Talaromyces atroroseus的脫羧酶(gallatdecarboxylase，GDC)、來自Acinetobacter radioresistens的兒茶酚雙加氧酶(catecholdioxygenase，CatA)。利用同時(shí)含有上述三種酶的工程菌，通過簡單的發(fā)酵工藝和酶級聯(lián)催化將木質(zhì)素衍生香蘭酸轉(zhuǎn)變?yōu)檎晨邓幔鶕?jù)本發(fā)明的實(shí)施例，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示50mM香蘭酸底物可以實(shí)現(xiàn)粘康酸收率高達(dá)87％。由此，可將木質(zhì)素廢棄物制作成粘康酸，再利用粘康酸制作己二酸，變廢為寶，具有較好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和工業(yè)應(yīng)用前景。

另外，根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例提出的以木質(zhì)素衍生物生產(chǎn)粘康酸的工程菌構(gòu)建方法，還可以具有如下附加的技術(shù)特征：

可選地，所述香蘭酸去甲基化酶基因VanAB基因是以惡臭假單胞菌KT2440基因組為模板，以SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示序列為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到。