[發明專利]一種利用角質酶促進蛋白在枯草芽孢桿菌中胞外表達的方法

有效

• 申請號: 202011208395.6
• 申請日: 2020-11-03
• 公開（公告）號: CN112301015B
• 公開（公告）日: 2022-03-04
• 發明（設計）人: 吳敬;宿玲恰;黃燕
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;C12N15/55;C12N1/21;C12N15/75;C12R1/125
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了一種利用角質酶促進蛋白在枯草芽孢桿菌中胞外表達的方法，屬于生物工程、酶工程、微生物工程技術領域。本發明采用角質酶突變體和目標蛋白在枯草芽孢桿菌中共表達，目標蛋白包括木糖異構酶、4,6?α?葡萄糖基轉移酶、4?α?糖基轉移酶、海藻糖合酶和分支酶等，可實現胞內定位目標蛋白胞外表達，提高生產效率、簡化后提取工藝，具有較高的學術意義和應用價值。

技術領域

本發明涉及一種利用角質酶促進蛋白在枯草芽孢桿菌中胞外表達的方法，屬于基因工程、酶工程、微生物工程技術領域。

背景技術

蛋白質的胞外表達可簡化下游純化工藝，節約成本，在大規模工業化生產中具有絕對優勢。而對于天然胞內定位型蛋白，通常只能在細胞內進行表達，并且需要利用物理或化學方法對細胞進行破碎才能獲得目的蛋白，后續提取工藝不但繁瑣而且成本較高，因此尋找能夠有效的簡化下游提取步驟降低產物純化成本成為了研究者的目標。

發明人課題組在前期研究中發現，角質酶在無信號肽介導的情況下實現了在大腸桿菌系統中高效胞外基質“分泌”型表達，盡管這種“分泌”機制還未完全解析，但是推測該現象與角質酶有限的磷脂水解活性引發的膜通透性增強有關。此外，發明人課題組還發現，當角質酶在大腸桿菌中與胞內蛋白共表達時，該效應還能夠引發天然胞內定位型蛋白的胞外釋放，并且在此過程中未發現明顯的細胞裂解現象，因此，不會對下游分離提取過程產生明顯的不利影響。當角質酶與天然胞內定位型蛋白在大腸桿菌中共表達時，角質酶能夠在一定程度水解細胞膜的磷脂成分，增加細胞膜的通透性，保證細胞完整性的情況下使天然胞內定位型蛋白分泌到胞外，為重組胞內定位型酶的胞外表達提供了一種新的方向；但是大腸桿菌是非食品用菌株，其安全性不可控，因此，無法擴大其應用范圍。

而枯草芽孢桿菌屬于革蘭氏陽性菌，具備無致病性，環境兼容性好、不易產生抗藥性等優點，而且還具有良好的發酵基礎，其培養簡單快速，已被美國食品藥物管理局和中國相關部門認定為食品安全級菌株GRAS(Generally recognized as safe)，目前廣泛用于生產各種工業用酶。

發明人課題組嘗試將角質酶與天然胞內定位型蛋白在大腸桿菌中共表達的技術方案應用于枯草芽孢桿菌表達系統中時，由于大腸桿菌的細胞膜的組成成分與枯草芽孢桿菌細胞膜的組成成分不同，以及大腸桿菌表達系統與枯草芽孢桿菌表達系統的差異，導致天然胞內定位型蛋白的胞外分泌效果不佳，因此，如何實現天然胞內定位型蛋白胞外分泌，以及如何才能得到一種安全、高效的天然胞內定位型蛋白胞外分泌成為了亟待解決的問題。

發明內容

針對現有技術中采用大腸桿菌表達系統實現天然胞內定位型蛋白的胞外表達中，存在的不安全性問題，本發明為了得到一種安全、高效的天然胞內定位型蛋白胞外分泌的方法，首先提供了一種角質酶突變體，所述角質酶突變體是將氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的角質酶的第175、177、178、207、209、213、214位中的一個或多個位點進行突變得到的。

在本發明的一種實施方式中，所述角質酶來源于嗜熱單孢菌Thermobifidafusca。

所述角質酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本發明的一種實施方式中，所述角質酶突變體為，將氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的角質酶的第175、177、178、207、209、213或214位的氨基酸突變為丙氨酸得到的，分別命名為：L175A、T177A、I178A、T207A、F209A、I213A、P214A。

在本發明的一種實施方式中，所述突變體是將第175位置的亮氨酸(Leu)變成丙氨酸(Ala)，同時將第177位置的蘇氨酸(Thr)變成丙氨酸(Ala)，得到L175A/T177A。

在本發明的一種實施方式中，所述突變體是將第207位置的蘇氨酸(Thr)變成丙氨酸(Ala)，同時將第209位置的苯丙氨酸(Phe)變成丙氨酸(Ala)，得到T207A/F209A。