[發(fā)明專利]檢測大腸埃希氏菌O157的實時熒光RAA的引物、探針、試劑盒和檢測方法

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• 申請日: 2020-11-03
• 公開（公告）號: CN112126698A
• 公開（公告）日: 2020-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔣原;申進玲;趙麗娜;韓偉;郭德華;楊捷琳;薛峰
• 申請（專利權(quán)）人: 上海海關(guān)動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/19
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31227
• 代理人: 范艷靜

本發(fā)明提供了一種檢測大腸埃希氏菌O157的實時熒光RAA的引物、探針、試劑盒和檢測方法，引物的序列中上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示；探針的序列為如SEQ ID NO.3所示；試劑盒包括引物、探針、緩沖液和純化水，RAA檢測方法：提取樣品DNA，以樣品DNA為模板，利用試劑盒進行RAA擴增，并在擴增過程中進行實時熒光檢測；本發(fā)明的實時熒光RAA檢測方法的特異性達100％，靈敏度達8.0×10¹cfu/mL，15min內(nèi)可得到結(jié)果，比實時熒光PCR方法更快速。該方法簡便、快速、靈敏、便攜、價格低廉，可用于疾病監(jiān)測、食品安全檢測，適合基層實驗室推廣應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測大腸埃希氏菌O157的實時熒光RAA的引物、探針、試劑盒和檢測方法。

背景技術(shù)

大腸埃希氏菌O157是腸出血性大腸埃希氏菌最重要的一群，具有極低的感染劑量(小于100個細(xì)胞)，可導(dǎo)致腹瀉、出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒綜合癥等。自首次發(fā)現(xiàn)因該致病菌引起的食物中毒以來，O157引起的疫情開始逐漸擴散和蔓延，相繼在英國、加拿大和日本等多個國家引起腹瀉爆發(fā)和流行。目前已發(fā)現(xiàn)可通過多種食物傳播，包括香腸、未消毒的牛奶、生菜、香瓜、蘋果汁和蘿卜苗等。傳統(tǒng)的O157檢測方法依賴形態(tài)及生化特性，因此存在操作復(fù)雜繁瑣、檢測周期長、自動化程度低和無法批量化處理等缺點，難以滿足短保質(zhì)期食品快速放行、現(xiàn)場執(zhí)法監(jiān)管、食品安全突發(fā)事件應(yīng)對處理以及舉辦重大活動時快速檢測的需求。近年來，基于免疫和核酸的各種快速檢測方法發(fā)展起來，免疫方法特異性和靈敏度較差，而基于核酸的方法具有快速、靈敏和準(zhǔn)確等優(yōu)點，主要以實時熒光PCR法為主。然而，實時熒光PCR基于熱循環(huán)儀，儀器昂貴，且對操作人員要求高，因此在基層實驗室推廣應(yīng)用較為困難。

重組酶等溫核酸擴增技術(shù)(Recombinase Aided Amplification,RAA)是新一代核酸分子檢測技術(shù)，該技術(shù)利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白、DNA聚合酶在等溫(37-39℃)條件下進行核酸擴增，結(jié)合熒光探針實現(xiàn)即時檢測，是一種精準(zhǔn)、方便、快速的核酸檢測技術(shù)，實現(xiàn)5-15min完成檢測輸出結(jié)果，比實時熒光PCR技術(shù)更快速和便捷。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的首要目的是提供一種檢測大腸埃希氏菌O157的實時熒光RAA的引物和探針。

本發(fā)明的第二個目的是提供包括上述引物和探針的試劑盒。

本發(fā)明的第三個目的是提供利用上述試劑盒的RAA檢測方法。

為達到上述首要目的，本發(fā)明的解決方案是：

一種檢測大腸埃希氏菌O157的實時熒光RAA的引物和探針，引物的序列為：

上游引物：TTGTCACGAATGACAAAACACTTTATGACCG；SEQ ID NO.1；

下游引物：TCAGCTTGTTCTAACTGGGCTAATCCTATAGC；SEQ ID NO.2；

探針的序列為：TAGCTGTACATAGGCAATATTGGCATGACGTT(FAM)-THF-T(BHQ1)-AGGCTACAATTATAG(3'blocker)；SEQ ID NO.3。

進一步地，上游引物為30bp，下游引物為32bp，探針為49bp，探針共有4個修飾基團，分別為熒光基團、四氫呋喃、淬滅基團和C3-spacer，熒光基團為FAM，淬滅基團為BHQ1，F(xiàn)AM和BHQ1均在T位置修飾，F(xiàn)AM和BHQ1中間間隔1個堿基，被四氫呋喃替換，C3-sapacer位于3’端末尾。

為達到上述第二個目的，本發(fā)明的解決方案是：

一種檢測大腸埃希氏菌O157的實時熒光RAA的試劑盒，其包括上述的引物、探針、緩沖液和純化水。