[發明專利]檢測大腸埃希氏菌O157的實時熒光RAA的引物、探針、試劑盒和檢測方法

在審

• 申請號: 202011207751.2
• 申請日: 2020-11-03
• 公開（公告）號: CN112126698A
• 公開（公告）日: 2020-12-25
• 發明（設計）人: 蔣原;申進玲;趙麗娜;韓偉;郭德華;楊捷琳;薛峰
• 申請（專利權）人: 上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/19
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 范艷靜

1.一種檢測大腸埃希氏菌O157的實時熒光RAA的引物和探針，其特征在于，所述引物的序列為：

上游引物：TTGTCACGAATGACAAAACACTTTATGACCG；SEQ ID NO.1；

下游引物：TCAGCTTGTTCTAACTGGGCTAATCCTATAGC；SEQ ID NO.2；

探針的序列為：TAGCTGTACATAGGCAATATTGGCATGACGTT(FAM)-THF-T(BHQ1)-AGGCTACAATTATAG(3'blocker)；SEQ ID NO.3。

2.根據權利要求1所述的引物和探針，其特征在于，上游引物為30bp，下游引物為32bp，探針為49bp，探針共有4個修飾基團，分別為熒光基團、四氫呋喃、淬滅基團和C3-spacer，熒光基團為FAM，淬滅基團為BHQ1，FAM和BHQ1均在T位置修飾，FAM和BHQ1中間間隔1個堿基，被四氫呋喃替換，C3-sapacer位于3’端末尾。

3.一種檢測大腸埃希氏菌O157的實時熒光RAA的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1或2所述的引物和探針。

4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括緩沖液和純化水。

5.一種檢測大腸埃希氏菌O157的實時熒光RAA的方法，其特征在于，其包括如下步驟：

(1)、提取樣品DNA；

(2)、以樣品DNA為模板，利用試劑盒進行重組酶介導等溫核酸擴增，并在擴增過程中進行實時熒光檢測；

所述試劑盒為權利要求3所述的試劑盒。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述重組酶介導等溫核酸擴增的反應體系為：緩沖液為25μL，上游引物為10μmol/L、2.1μL，下游引物為10μmol/L、2.1μL，探針為10μmol/L、0.6μL，純化水為13.7μL，總體積為43.5μL。

7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述重組酶介導等溫核酸擴增的反應條件為：39℃反應30min。