[發(fā)明專利]一種基于等溫擴(kuò)增技術(shù)的檢測微囊藻毒素合成基因mcyG的試劑盒及其方法

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• 申請日: 2020-11-03
• 公開（公告）號: CN112301107A
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李晶晶;于鑫;林文芳
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了一種基于等溫擴(kuò)增技術(shù)的檢測微囊藻毒素合成基因mcyG的試劑盒及方法，其特征是基于重組酶介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增技術(shù)并結(jié)合側(cè)向?qū)游鲈嚰埣夹g(shù)開發(fā)的。所述試劑盒包括酶凍干粉末，引物，探針，反應(yīng)緩沖液，硫酸鎂溶液，側(cè)向?qū)游鲈嚰垼蠘泳彌_液，雙蒸無菌水和mcyG的DNA。所述的方法為利用凍裂法或微波法快速提取DNA，反應(yīng)體系置于37℃?45℃，反應(yīng)15min以上，產(chǎn)物稀釋100?200倍后，取5?10μL上樣試紙，試紙直立于PBST緩沖溶液中5?10min，即可讀取結(jié)果。本發(fā)明所述的試劑盒及方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡單，耗時短，可用于實(shí)際水體中產(chǎn)毒藍(lán)藻的快速檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基于等溫擴(kuò)增技術(shù)的檢測微囊藻毒素合成基因mcyG的試劑盒及其方法，其特征是基于重組酶介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增技術(shù)，可用于微囊藻毒素合成基因mcyG的野外現(xiàn)場快速檢測，可實(shí)現(xiàn)對產(chǎn)毒藍(lán)藻水華的監(jiān)測和預(yù)警，屬于水質(zhì)監(jiān)測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

近年來,湖泊水庫富營養(yǎng)化日趨常態(tài)化,進(jìn)而導(dǎo)致藍(lán)藻水華的頻發(fā).微囊藻是最常見的一種水華藍(lán)藻,有些微囊藻會分泌微囊藻毒素，這類微囊藻被稱為產(chǎn)毒微囊藻，如銅綠微囊藻、魚害微囊藻。微囊藻毒素一旦進(jìn)入水體中，會污染水源，微囊藻毒素可通過消化道途徑進(jìn)入人體，引起肝臟等器官的損傷，嚴(yán)重者中毒甚至死亡。

目前，產(chǎn)毒微囊藻的檢測方法分為兩類，一類通過檢測微囊藻毒素來檢測，方法包括液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、飛行時間質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫法、磷酸蛋白酶抑制法等，另一類通過檢測微囊藻毒素合成基因（mcyA、mcyB、mcyE、mcyG等），如常規(guī)的PCR法、定量PCR法、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）法等。這些方法能夠滿足高靈敏檢測微囊藻毒素的需要，對于微囊藻毒素的檢測具有重要參考意義。但是這些方法中大多數(shù)對操作的人員和檢測設(shè)備要求都很高，只有酶聯(lián)免疫法和環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)法可以應(yīng)用于對產(chǎn)毒微囊藻的快速鑒定。酶聯(lián)免疫法過于靈敏，檢測結(jié)果假陽性概率很高，環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)引物設(shè)計復(fù)雜，反應(yīng)需在65℃孵育60min完成，耗時長，兩種方法皆存在不足之處。因此，開發(fā)一種可適用于野外現(xiàn)場快速檢測水中微囊藻毒素合成基因mcyG的試劑盒及其方法是十分必要的。

重組酶聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是一種基于重組酶介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增技術(shù)，該反應(yīng)能在37℃-45℃的溫度范圍進(jìn)行（人體腋下溫度就可以反應(yīng)），能夠在15-40分鐘內(nèi)進(jìn)行單分子核酸檢測。該技術(shù)對硬件設(shè)備的要求很低，可用于微囊藻毒素合成基因mcyG的快速檢測。本發(fā)明提供的一種檢測微囊藻毒素合成基因mcyG試劑盒及其方法，是基于RPA技術(shù)并結(jié)合側(cè)向?qū)游鲈嚰垼╨ateral flow strips，LF）開發(fā)的，可實(shí)現(xiàn)對微囊藻毒素合成基因mcyG的野外現(xiàn)場快速檢測。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有微囊藻毒素及其產(chǎn)毒藻類快速檢測技術(shù)的不足，提供一種基于等溫擴(kuò)增技術(shù)的檢測微囊藻毒素合成基因mcyG的試劑盒及其方法，是基于重組酶介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增技術(shù)并結(jié)合側(cè)向?qū)游鲈嚰堥_發(fā)的，可適用于野外對微囊藻毒素合成基因mcyG的現(xiàn)場快速檢測。

一種基于等溫擴(kuò)增技術(shù)的檢測微囊藻毒素合成基因mcyG的試劑盒，所述試劑盒包括酶凍干粉末，正反向引物, 探針，RPA反應(yīng)緩沖液，硫酸鎂溶液，側(cè)向?qū)游鲈嚰垼蠘泳彌_液，雙蒸無菌水和微囊藻毒素合成基因mcyG的DNA。

所述的RPA反應(yīng)引物如表1所示，所設(shè)計的2對引物組合M1、M2均可以現(xiàn)實(shí)對微囊藻毒素合成基因mcyG的特異性擴(kuò)增，所有反向引物的5’端均用Biotin（生物素）標(biāo)記。

所述的反向引物的標(biāo)記方式不限于Biotin標(biāo)記，也可以用其他標(biāo)記物代替，如DIG、FITC、FAM等。

所述的RPA反應(yīng)探針如表1所示，探針mcyG-P在5’端用FAM標(biāo)記，用THF（四氫呋喃堿基）代替第33個堿基，用SpacerC3封閉3’端。