[發(fā)明專利]一種基于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的檢測微囊藻毒素合成基因mcyG的試劑盒及其方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202011206506.X
• 申請日: 2020-11-03
• 公開（公告）號: CN112301107A
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李晶晶;于鑫;林文芳
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種基于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的檢測微囊藻毒素合成基因mcyG的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括酶凍干粉末，正反向引物, 探針，RPA反應(yīng)緩沖液，硫酸鎂溶液，側(cè)向?qū)游鲈嚰垼蠘泳彌_液，雙蒸無菌水和微囊藻毒素合成基因mcyG的DNA。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測微囊藻毒素合成基因mcyG的試劑盒，其特征在于，所述的RPA反應(yīng)引物如表1所示，所設(shè)計(jì)的2對引物組合M1、M2均可以現(xiàn)實(shí)對微囊藻毒素合成基因mcyG的特異性擴(kuò)增，所有反向引物的5’端均用Biotin（生物素）標(biāo)記；所述的反向引物的標(biāo)記方式不限于Biotin標(biāo)記，也可以用其他標(biāo)記物代替，如DIG、FITC、FAM等。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測微囊藻毒素合成基因mcyG的試劑盒，其特征在于，所述的RPA反應(yīng)探針如表1所示，探針mcyG-P在5’端用FAM標(biāo)記，用THF（四氫呋喃堿基）代替第33個(gè)堿基，用SpacerC3封閉3’端；所述的RPA反應(yīng)探針mcyG-P對于M1和M2引物組合都適用，均可以特異性地檢測微囊藻毒素合成基因mcyG；所述的RPA反應(yīng)探針的標(biāo)記方式不限于FAM標(biāo)記，也可以用其他標(biāo)記物代替，如Biotin、FITC、FAM等；所述的RPA反應(yīng)探針3’端的封閉方式可以不限于SpacerC3，也可以用其他封閉方式代替，如磷酸鹽、雙脫氧核苷酸等。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測微囊藻毒素合成基因mcyG的試劑盒，其特征在于，所述側(cè)向?qū)游鲈嚰埱岸税挥蠪AM抗體修飾的納米金粒子，檢測線上包被有Biotin抗體，質(zhì)控線包被有固定抗體（可以與帶抗體的納米金粒子結(jié)合顯色）；所述的側(cè)向?qū)游鲈嚰埱岸税坏募{米金粒子上修飾的抗體不限于FAM抗體，可以用其他探針修飾的標(biāo)記物的抗體代替；所述的側(cè)向?qū)游鲈嚰埖臋z測線上包被的抗體可以不限于Biotin抗體，可以用其他反向引物修飾的標(biāo)記物的抗體代替。

5.一種基于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的檢測微囊藻毒素合成基因mcyG的方法，其特征在于，按照以下操作步驟進(jìn)行：

（1）快速裂解藍(lán)藻細(xì)胞提取DNA（以下兩種方法均可）

凍裂法：取1mL藍(lán)藻水樣移至1.5 mL離心管，通過高速離心（15000rpm/min，5-10 min）收集藍(lán)藻細(xì)胞，棄上清液，保留沉淀，加入50μL雙蒸水或細(xì)胞裂解液，重懸藍(lán)藻細(xì)胞，將置于液氮或-80℃冰箱3-5 min，取出樣品，于38-45℃水浴鍋或金屬浴中恒溫放置1-2min，重復(fù)凍融操作3次，高速離心樣品（15000rpm/min，10 min），取上清液作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)DNA樣品；

微波法：取1mL藍(lán)藻水樣移至1.5 mL離心管，通過高速離心（15000rpm/min，5-10 min）收集藍(lán)藻細(xì)胞，棄上清液，保留沉淀，加入50μL細(xì)胞裂解液，重懸藍(lán)藻細(xì)胞，將重懸的藍(lán)藻樣品置于一個(gè)帶蓋的微波爐專用盒中，蓋上蓋子，放進(jìn)微波爐中750 W功率或中高溫，加熱1-3min；取出樣品，放入離心機(jī)中，高速離心樣品（15000rpm/min，10 min），取上清液作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)DNA樣品；

（2）準(zhǔn)備反應(yīng)體系：

RPA酶凍干粉末中加入RPA反應(yīng)緩沖液25-30μL，10 μmol/L正向引物1-2.4 μL，10 μmol/L反向引物1-2.4 μL，10 μmol/L探針0.1-0.6μL， 280 mmol/L醋酸鎂2.5 μL，DNA模板0.5-1 μL，加雙蒸無菌水補(bǔ)足體積至50 μL，以上操作均放置在冰盒進(jìn)行，快速離心混勻；

（3）反應(yīng)過程：反應(yīng)體系置于37-40℃恒溫環(huán)境（恒溫水浴或金屬浴）孵育15-30min；取出放置在冰盒上，將反應(yīng)產(chǎn)物加入上樣緩沖液按50-200倍稀釋，取5-10μL直接加在側(cè)向?qū)游鲈嚰埖那岸耍瑢?cè)向?qū)游鲈嚰堉糜?00-200μL的上樣緩沖液孵育5-10min，取出，即可通過肉眼直接讀取結(jié)果；

（4）結(jié)果判定：當(dāng)側(cè)向?qū)游鲈嚰埳现挥猩隙说馁|(zhì)控線顯色時(shí)，結(jié)果為陰性，說明檢測的樣品中不存在微囊藻毒素合成基因mcyG；當(dāng)側(cè)向?qū)游鲈嚰埳腺|(zhì)控線和檢測線同時(shí)顯色時(shí)，結(jié)果為陽性，說明檢測的樣品中存在微囊藻毒素合成基因mcyG；當(dāng)側(cè)向?qū)游鲈嚰埳腺|(zhì)控線不顯色時(shí)，說明本次檢測無效，需要重新檢測。