[發明專利]一種臍帶間充質干細胞的培養方法及其應用

在審

• 申請號: 202011205241.1
• 申請日: 2020-11-02
• 公開（公告）號: CN112111450A
• 公開（公告）日: 2020-12-22
• 發明（設計）人: 鄭大學;劉偉;丁星
• 申請（專利權）人: 貴州北科生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A01N1/02
• 代理公司: 深圳市鼎智專利代理事務所(普通合伙) 44411
• 代理人: 曹勇

1.一種臍帶間充質干細胞的培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

S10：對脫離人體的臍帶間充質干細胞進行制備；

S101：取出所需的耗材整齊排列在物料推車上，對耗材進行消毒，將其放入已清潔的生物安全柜中，取出完全培養基，放置在物料推車上待其恢復至室溫；

S102：在生物安全柜中央間隔排放六個培養皿，其中五個培養皿倒入30-40mL的0.9％氯化鈉注射液備用；

S103：向臍帶采集瓶中倒入75％醫用酒精，浸沒臍帶，對臍帶消毒滅菌，用無菌止血鉗從臍帶采集瓶中取出臍帶并放入第一個培養皿，使其浸泡在0.9％氯化鈉注射液中，去除臍帶表面血漬、粘液，將臍帶轉移至第二個培養中重復洗滌，以徹底去除臍帶表面血漬；

S104：用無菌組織剪剪去臍帶兩端，棄去，將部分臍帶剪成小段，剩余臍帶裝入50mL離心管中做備份，并貼上對應標簽，清洗臍帶小段，去除淤血和凝塊，將臍帶小段轉移到第三個培養皿中洗滌，以徹底清除臍帶小段血管中淤血和凝塊；

S105：將臍帶小段移至第四個空的培養中，剔除靜脈和動脈，用有齒攝將華通氏膠從羊膜上剝離，放入第五個培養血中，用攝子將膠體撕成小塊，再進行洗滌，將洗滌后的膠體轉入第六個培養血，再次洗滌；

S106：將洗滌后的膠體從培養皿轉移至50mL離心管，用無菌組織剪將華通氏膠體剪切成1-4mm3的組織勻漿塊。

2.根據權利要求1所述的一種臍帶間充質干細胞的培養方法，其特征在于，還包括以下步驟：

S20：臍帶間充質干細胞的培養：

S201：華通氏膠組織勻漿種瓶培養：

用移液管加入完全培養基到T75培養瓶中，9mL/瓶，用移液管吸取剩余組織塊勻漿均勻加T75培養瓶中接種，接種量為0.8-1mL/瓶，搖勻，將搖勻后的T75培養瓶放入CO2培養箱37.0℃、5.0％CO2濃度條件下進行培養；

離心上清液送檢，用待用的離心上清倒入剩余的膠體中，取樣送檢“細菌及真菌檢測”，每瓶無菌檢測瓶注射量應不少于4mL；余下上清液廢棄。加入約10mL完全培養基到備份臍帶管中作為樣本保存液。

S202：第一次換液：

臍帶華通氏膠培養第五天進行第一次換液；

S203：第二次換液：

用移液管輕輕吸掉7mL培養上清液，加入7mL完全培養基；將搖勻后的T75培養瓶放入37.0℃、5.0％CO2濃度條件下培養；

S204：原代細胞傳代；

S205：種瓶培養：種瓶數＝收獲細胞總數/(175×種瓶密度)接種細胞定容體積＝細胞瓶數×1mL；傳代后72h±24h鏡下觀察細胞融合度達到85％-90％時，進行細胞凍存，當收獲活細胞總量不低于10×106個，活率不低于90％,則進行細胞凍存，否則進行細胞傳代。

3.根據權利要求1所述的一種臍帶間充質干細胞的培養方法，其特征在于，還包括以下步驟：

S30：種子細胞收獲凍存：

S301：將細胞懸液轉移至離心管，用0.9％氯化鈉注射液洗滌培養瓶內壁，洗液一并轉移至離心管中，定容到一定體積；

S302：加凍存液：用5mL移液管取4mL在2-8℃預冷的10％凍存液，加入到細胞中，輕輕吹打均勻；

S303：分裝細胞：取4個空的1.8mL凍存管貼上凍存細胞標簽；

S304：將細胞懸液平均分裝于1.8mL凍存管中，并存儲在高效氣相液氮存儲罐中。

4.根據權利要求1所述的一種臍帶間充質干細胞的培養方法，其特征在于，在所述的S20中，還包括以下步驟：

S206：對培養好的臍帶間充質干細胞建立數據庫、供者健康信息資料數據庫，提供和各項報告相一致的數據和條形碼。

5.根據權利要求1所述的一種臍帶間充質干細胞的培養方法及其應用，其特征在于，在所述的S20中，臍帶間充質干細胞培養是在Ultraculture(無血清培養基)培養液中進行，收集的細胞包括第一代，和培養之后的二，三代。