[發明專利]高產血紅素的重組質粒和基因工程菌株及其構建方法、高產血紅素的方法

有效

• 申請號: 202011204558.3
• 申請日: 2020-11-02
• 公開（公告）號: CN112301049B
• 公開（公告）日: 2022-10-28
• 發明（設計）人: 俞漢青;李洋;湯強;劉東風
• 申請（專利權）人: 中國科學技術大學
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N1/21;C12P17/18;C12R1/01
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 潘穎

本發明涉及代謝工程領域，特別涉及高產血紅素的重組質粒和基因工程菌株及其構建方法、高產血紅素的方法。該重組質粒包括如下基因：hemA、hemL、hemB1、hemB2、hemC、hemD、hemE、hemN、hemG1、hemG2、hemG3、hemH1、hemH2和ccmf。本發明利用了代謝工程和合成生物學手段對S.oneidensis MR?1進行改造，從而高效的合成血紅素。將這種方法應用于電活性細菌的工程化改造將有助于這類細菌在精細化學品生產中的應用。

技術領域

本發明涉及代謝工程領域，特別涉及高產血紅素的重組質粒和基因工程菌株及其構建方法、高產血紅素的方法。

背景技術

目前血紅素的生產主要是利用有機萃取或酶促水解從生物樣品(例如植物組織和動物血液)中分離游離血紅素，不僅過程復雜、產量低、耗時而且會造成污染問題。代謝工程技術的發展為利用微生物細胞工程生產血紅素提供了契機。

電活性細菌進化出了獨特的胞外電子傳遞方式用以在厭氧環境中利用多種電子受體完成細胞呼吸代謝過程。該類微生物也因此在能量回收、化學品生產、環境修復等方面具有重要作用。迄今為止，人們從環境中分離出多種異化金屬還原細菌，如Shewanellaspp.,Geobacter spp.,Pseudomonas spp.,Listeria spp.，并對其胞外電子傳遞通路進行了表征。作為一株模式異化金屬還原細菌，Shewanella oneidensis MR-1受到人們的廣泛關注。它利用一個復雜的胞外電子傳遞網絡將胞內代謝產生的電子傳遞到胞外電子受體。具體步驟為：該菌首先將胞內L-乳酸氧化分解產生的電子匯聚到NADH池，隨后電子通過醌池到達內膜和周質中的多種氧化還原終端酶或者外膜上的孔蛋白-細胞色素復合體(OmcA-MtrCAB)，并最終通過直接和間接的方式傳遞到胞外電子受體。電活性細菌獨特的胞外電子傳遞特性為利用微生物電化學系統(MES)電合成生產血紅素提供了可能。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了高產血紅素的重組質粒和基因工程菌株及其構建方法、高產血紅素的方法。本發明提供的高產血紅素的質粒系統和宿主體系，用于實現血紅素的高效和放大生產。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種高產血紅素的重組質粒，所述重組質粒包括如下基因：hemA、hemL、hemB1、hemB2、hemC、hemD、hemE、hemN、hemG1、hemG2、hemG3、hemH1、hemH2和ccmf。

作為優選，hemA、hemL、hemB1、hemB2、hemC、hemD、hemE、hemN、hemG1、hemG2、hemG3、hemH1、hemH2和ccmf的基因來源為E.coli MG1655。

作為優選，重組質粒的質粒載體為pBF-PTetO。

作為優選，質粒載體的序列如SEQ ID NO：1所示。

作為優選，重組質粒的序列如SEQ ID NO：2所示。

本發明還提供了該重組質粒的構建方法，包括如下步驟：

以質粒載體為模板，擴增得到質粒骨架；

將基因hemA、hemL、hemB1、hemB2的DNA片段與質粒骨架進行組裝，得到質粒-HE1；

將基因hemC、hemD、hemE、hemN的DNA片段與質粒骨架進行組裝，得到質粒-HE2；

將基因hemG1、hemG2、hemG3、hemH1、hemH2的DNA片段與質粒骨架進行組裝，得到質粒-HE3；

將基因ccmF與質粒骨架進行組裝，得到質粒-HE4；