[發明專利]一種精確調控重組蛋白表達的方法

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• 申請號: 202011202574.9
• 申請日: 2020-11-02
• 公開（公告）號: CN112301047A
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 田敬東;龔輝;呂永維;顧小雨
• 申請（專利權）人: 江蘇東玄基因科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K14/00
• 代理公司: 江蘇昆成律師事務所 32281
• 代理人: 劉尚軻

本發明公開了一種精確調控重組蛋白表達的方法，其包括1)cNDA庫設計：根據設定規則設計編碼目標蛋白的多條cDNA序列，同時合成設計的所有cDNA序列，形成cDNA庫；2)cNDA庫表達：然后將cDNA庫克隆到適宜的表達載體中，在指定的表達宿主或表達體系中表達；3)表達篩選：根據所表達蛋白的特性或使用其它物理、化學或生物的方法對克隆進行篩選；4)克隆驗證：最終挑選出最大限度滿足蛋白表達需要的克隆。本發明通過設計合成編碼目標蛋白的cDNA庫，在指定的表達宿主或體系中表達篩選，最終挑選出最大限度滿足蛋白表達需要的克隆。

【技術領域】

本發明屬于生物技術領域，特別是涉及一種精確調控重組蛋白表達的方法。

【背景技術】

基因表達是指儲存在cDNA序列中的遺傳信息經過轉錄和翻譯，最終生成具有生物活性的蛋白質分子的過程。基因工程、蛋白質工程、生物制藥以及合成生物學的快速發展需要將各種不同的重組蛋白在各種特定的宿主細胞或人工表達系統中表達出來。通常用來表達蛋白的宿主細胞包括細菌、酵母、昆蟲、植物、動物細胞和無細胞表達體系等。根據最終的目的和用途，對所表達重組蛋白的量、可溶度和生物活性都有嚴格要求。但因為重組蛋白的cDNA序列往往與異源宿主細胞或非細胞表達體系不相匹配，重組蛋白的表達會受到很大影響，多數情況下不能滿足實驗要求。目前常用的密碼子計算機軟件設計因為種種限制也無法預測和控制蛋白表達效果，因此迫切需要一種精確有效的控制重組蛋白表達的實驗方法。

【發明內容】

本發明的主要目的在于提供一種精確調控重組蛋白表達的方法，通過設計合成編碼目標蛋白的cDNA庫，在指定的表達宿主或體系中表達篩選，最終挑選出最大限度滿足蛋白表達需要的克隆。

本發明通過如下技術方案實現上述目的：一種精確調控重組蛋白表達的方法，其包括以下步驟：

1)cNDA庫設計：根據設定規則設計編碼目標蛋白的多條cDNA序列，同時合成設計的所有cDNA序列，形成cDNA庫。

具體的，所述cNDA庫設計具體包括：

11)根據對蛋白表達量和可溶性的設定要求，選擇使用頻率在設定區間的密碼子，而不是單純選擇使用頻率最高的密碼子；

12)根據對蛋白表達量和可溶性的設定要求，選擇設定GC％含量的密碼子；

13)根據對蛋白表達量和可溶性的設定要求，在蛋白序列的設定區域內通過選擇不同GC％含量的密碼子，控制該區域的平均GC％含量；

14)通過選擇不同的密碼子，減少DNA二級結構；

15)通過選擇不同的密碼子，減少DNA重復序列；

16)通過選擇不同的密碼子，刪除不需要的DNA序列；

17)經過上述選擇后得到cDNA庫。

2)cNDA庫表達：然后將cDNA庫克隆到適宜的表達載體中，在指定的表達宿主或表達體系中表達。

3)表達篩選：根據所表達蛋白的特性或使用其它物理、化學或生物的方法對克隆進行篩選。

所述表達篩選包括以下步驟：

31)表達蛋白；

32)提取蛋白；

33)通過蛋白的物理、化學或生物特性進行篩選，例如使用所表達蛋白或酶本身的物化特性或生物活性進行篩選；使用共表達的融合標記蛋白，如GFP等熒光蛋白、LacZ等顯色蛋白、His6、GST等親和力標記；使用高通量、自動化的篩選方式，如酶標儀、質譜儀、自動圖像識別處理裝置等。

4)克隆驗證：最終挑選出最大限度滿足蛋白表達需要的克隆。