[發明專利]凝血酶含量的檢測方法

在審

• 申請號: 202011196943.8
• 申請日: 2020-10-30
• 公開（公告）號: CN112326613A
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發明（設計）人: 安新民;張愛眾;張保柱
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/573
• 代理公司: 北京思元知識產權代理事務所(普通合伙) 11598
• 代理人: 余光軍;霍雪梅

1.一種凝血酶含量的檢測方法，其特征在于，包括：

(1)繪制凝血酶的熒光標準曲線，包括

(a)氧化石墨烯的預處理：將氧化石墨烯在水溶液中用超聲處理得到氧化石墨烯分散液，備用；

(b)凝血酶與適配體結合的DNA-Cu/Ag NCs溶液的制備：將含適配體的DNA與不同濃度的凝血酶分別在Tris-HAc緩沖液中混勻并孵育后加入AgNO₃和Cu(NO₃)₂避光孵育；再加入NaBH₄混勻并孵育使Ag⁺和Cu²⁺還原為Ag和Cu，得到凝血酶與適配體結合的DNA-Cu/Ag NCs溶液；

(c)將步驟(a)所制得的氧化石墨烯分散液加入到步驟(b)所制得的凝血酶與適配體結合的DNA-Cu/Ag NCs溶液中孵育后，分別測定各混合溶液所對應的熒光值，根據最大熒光發射值繪制標準曲線；

(2)將待測的樣品液與含適配體的DNA在Tris-HAc緩沖液中混勻孵育后加入AgNO₃和Cu(NO₃)₂混合均勻避光孵育；再加入NaBH₄混勻并孵育；最后加入氧化石墨烯分散液混合均勻孵育后測定該混合溶液的熒光值；

(3)根據標準曲線，計算得到待測樣品液中凝血酶的含量。

2.按照權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟(a)所述的氧化石墨烯分散液中氧化石墨烯濃度為3mg/mL；所述的超聲處理是采用1500W的功率超聲處理40min。

3.按照權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟(b)所述的含適配體的DNA序列為SEQ ID NO.1所示；所述含適配體的DNA濃度優選為1.5μM。

4.按照權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟(b)中Cu(NO₃)₂、AgNO₃和NaBH₄的濃度分別為4.5μM、12μM和30μM。

5.按照權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟(b)中所述的不同濃度的凝血酶為0-14nM的凝血酶，所述Tris-HAc緩沖液的濃度為10mM,其pH值為7.0。

6.按照權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟(b)中所得到的凝血酶與適配體結合的DNA-Cu/Ag NCs的粒徑小于2nm。

7.按照權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟(b)中將含適配體的DNA與不同濃度的凝血酶分別在Tris-HAc緩沖液中混勻并孵育0.5h后加入AgNO₃和Cu(NO₃)₂混合均勻在4℃下避光孵育20-40min后再加入NaBH₄混勻并孵育1-2h。

8.按照權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟(c)中將步驟(a)所制得的氧化石墨烯分散液加入到步驟(b)所制得的凝血酶與適配體結合的DNA-Cu/Ag NCs溶液中孵育20min然后在室溫下分別測定各混合溶液所對應的熒光值，根據最大熒光發射值繪制標準曲線。

9.按照權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟(2)中將待測的樣品液與含適配體的DNA在Tris-HAc緩沖液中混勻孵育0.5h然后將AgNO₃和Cu(NO₃)₂加入到該混合溶液中，在4℃下避光孵育20-40min。

10.按照權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟(2)中最后所加入的氧化石墨烯分散液至其在混合溶液中的終濃度為45μg/mL。