[發明專利]凝血酶含量的檢測方法

在審

• 申請號: 202011196943.8
• 申請日: 2020-10-30
• 公開（公告）號: CN112326613A
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發明（設計）人: 安新民;張愛眾;張保柱
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/573
• 代理公司: 北京思元知識產權代理事務所(普通合伙) 11598
• 代理人: 余光軍;霍雪梅

本發明公開了凝血酶含量的檢測方法，包括：(1)繪制凝血酶的熒光標準曲線；(2)將待測樣品液與含適配體的DNA在緩沖液中混勻孵育后加入AgNO₃和Cu(NO₃)₂混勻孵育加入NaBH₄混勻孵育；加入氧化石墨烯分散液混勻孵育測定熒光值；(3)根據標準曲線計算待測樣品液中凝血酶的含量。本發明先將凝血酶與含適配體的DNA特異性結合再合成DNA?Cu/Ag NCs最后加入氧化石墨烯，既消除了背景熒光又避免了氧化石墨烯對凝血酶非特異性吸附，減少了對氧化石墨烯的修飾步驟。本發明線性范圍為2?10nM，最低檢測限為0.25nM，具有成本低廉、操作簡單、靈敏度高、選擇性好、毒性小、生物相容性好、免標記等優點。

技術領域

本發明涉及凝血酶含量的檢測方法，尤其涉及基于氧化石墨烯和適配體DNA-Cu/Ag NCs結合的凝血酶檢測方法，屬于凝血酶含量的檢測領域。

背景技術

凝血酶作為一種特殊的絲氨酸內蛋白酶，不僅在血管生成、血栓形成、凝血級聯和腫瘤生長止血等許多病理生理過程中發揮重要作用，而且還調節血小板聚集、內皮細胞活化以及在血管生物學中作為激素的重要響應。機體內的凝血酶必須保持在一定的濃度范圍，濃度過高會導致血栓形成，過低會導致出血。因此準確測定凝血酶的濃度對確定給定病人恰當的治療至關重要。

適配體是通過稱為“通過指數富集(SELEX)配體的系統進化”的特定過程分離的單鏈寡核苷酸。由于具有良好的穩定性、特異性、成本較低以及相對容易分離和修飾，因此在大分子或低分子量基質的生物傳感方面具有很大的應用前景。各種基于適配體用于凝血酶檢測的分析技術(包括比色法、熒光、電化學和表面增強拉曼散射)已經得到開發。

金屬納米簇是含有幾個到約一百個原子的納米材料，由于其獨特的物理、光學和電學性質,被廣泛地用于催化、生物醫學、成像、傳感以及光電設備等領域。其中，以DNA模板穩定的銅銀納米簇(簡稱DNA-Cu/Ag NCs)具有可優化的鏈長和序列、強的熒光發射、較低的毒性、較好的生物相容性等優點，倍受到研究者的重視。基于以上所述，可以將適配體與DNA-Cu/Ag NCs相結合來實現凝血酶的檢測。

由于適配體與DNA-Cu/Ag NCs相結合檢測凝血酶的探針有一定的背景熒光，直接影響檢測的靈敏性，有待改進。

發明內容

本發明的主要目的是提供一種基于氧化石墨烯和適配體DNA-Cu/Ag NCs結合的凝血酶檢測方法，該方法消除了DNA-Cu/Ag NCs的背景熒光，實現了對凝血酶簡單、快速、低成本、高靈敏的檢測。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案是：

一種凝血酶含量的檢測方法，包括：

(1)繪制凝血酶的熒光標準曲線，包括

(a)氧化石墨烯的預處理：將氧化石墨烯在水溶液中用超聲處理得到氧化石墨烯分散液，備用；

(b)凝血酶與適配體結合的DNA-Cu/Ag NCs溶液的制備：將含適配體的DNA與不同濃度的凝血酶分別在Tris-HAc緩沖液中混勻并孵育后加入AgNO₃和Cu(NO₃)₂避光孵育；再加入NaBH₄混勻并孵育使Ag⁺和Cu²⁺還原為Ag和Cu，得到凝血酶與適配體結合的DNA-Cu/Ag NCs溶液；

(c)將步驟(a)所制得的氧化石墨烯分散液加入到步驟(b)所制得的凝血酶與適配體結合的DNA-Cu/Ag NCs溶液中孵育后，分別測定各混合溶液所對應的熒光值，根據最大熒光發射值繪制標準曲線；