[發(fā)明專利]一種利用質(zhì)粒輔助進(jìn)行rAAV感染滴度檢測(cè)的方法及試劑盒

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011196673.0
• 申請(qǐng)日: 2020-10-30
• 公開（公告）號(hào): CN112280801A
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 潘杏;何曉斌;劉光猛;張勝;賈寧;王夢(mèng)蝶
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢樞密腦科學(xué)技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/35;C12N15/34;C12Q1/6897;C12Q1/70;C12R1/93
• 代理公司: 武漢華之喻知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42267
• 代理人: 彭翠;曹葆青

1.一種利用質(zhì)粒輔助進(jìn)行rAAV感染滴度檢測(cè)的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)對(duì)攜帶有E1a基因和E1b基因的HEK細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染外源質(zhì)粒，得到轉(zhuǎn)染外源質(zhì)粒的HEK細(xì)胞；其中，所述外源質(zhì)粒中包含編碼AAV病毒Cap蛋白的基因、編碼AAV病毒Rep蛋白的基因和腺病毒中對(duì)rAAV包裝起輔助功能的基因；所述E1a基因和E1b基因分別為編碼腺病毒E1a蛋白的基因和編碼腺病毒E1b蛋白的基因；

(2)在所述轉(zhuǎn)染外源質(zhì)粒的HEK細(xì)胞中進(jìn)行待檢測(cè)rAAV的梯度稀釋，由該待檢測(cè)rAAV提供野生型AAV基因組中決定其復(fù)制、包裝和整合必須的順式作用元件-基因組兩端的ITR序列，在所述轉(zhuǎn)染外源質(zhì)粒的HEK細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)rAAV的復(fù)制和增殖；

(3)通過檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)或檢測(cè)該細(xì)胞中復(fù)制和增殖產(chǎn)生的rAAV基因組拷貝數(shù)，計(jì)算待測(cè)rAAV的感染滴度。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述腺病毒中對(duì)rAAV包裝起輔助功能的基因包括編碼腺病毒E2a蛋白的基因、編碼腺病毒E4orf6蛋白的基因、編碼腺病毒VARNA蛋白的基因。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源質(zhì)粒為一個(gè)或多個(gè)，所述編碼AAV病毒Cap蛋白的基因、編碼AAV病毒Rep蛋白的基因和腺病毒中對(duì)rAAV包裝起輔助功能的基因被導(dǎo)入所述一個(gè)或多個(gè)外源質(zhì)粒中。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源質(zhì)粒包括RC質(zhì)粒和腺病毒輔助Helper質(zhì)粒，所述RC質(zhì)粒中包含編碼AAV病毒Cap蛋白的基因和編碼AAV病毒Rep蛋白的基因；所述Helper質(zhì)粒中包含編碼腺病毒E2a蛋白的基因、編碼腺病毒E4orf6蛋白的基因、編碼腺病毒VARNA蛋白的基因。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過程中還加入培養(yǎng)基DMEM和轉(zhuǎn)染試劑PEI-MAX，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染外源質(zhì)粒時(shí)，所述RC質(zhì)粒和Helper質(zhì)粒的添加質(zhì)量比為1:0.5-2；所述質(zhì)粒的添加總質(zhì)量與轉(zhuǎn)染試劑PEI-MAX的質(zhì)量比值1:2-1:3。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將攜帶有E1a基因和E1b基因的HEK細(xì)胞鋪于多孔板中靜置貼壁培養(yǎng)；

(2)待步驟(1)所述細(xì)胞貼壁后，采用PEI瞬時(shí)轉(zhuǎn)染所述外源質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后靜置培養(yǎng)數(shù)小時(shí)；

(3)將待測(cè)rAAV進(jìn)行10倍梯度稀釋，加入到步驟(2)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞孔中，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；

(4)通過測(cè)定每個(gè)稀釋梯度每個(gè)細(xì)胞孔內(nèi)所述待測(cè)rAAV中報(bào)告基因的表達(dá)量或目的基因的基因拷貝數(shù)，確定每個(gè)梯度的陽(yáng)性孔數(shù)；

(5)根據(jù)步驟(4)確定的每個(gè)梯度的陽(yáng)性孔數(shù)，計(jì)算待測(cè)rAAV的感染滴度。

7.一種利用質(zhì)粒輔助進(jìn)行rAAV感染滴度檢測(cè)的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括攜帶有E1a基因和E1b基因的HEK細(xì)胞以及外源質(zhì)粒；

其中，所述外源質(zhì)粒中包含編碼AAV病毒Cap蛋白的基因、編碼AAV病毒Rep蛋白的基因和腺病毒中對(duì)rAAV包裝起輔助功能的基因；所述E1a基因和E1b基因分別為編碼腺病毒E1a蛋白的基因和編碼腺病毒E1b蛋白的基因；

使用時(shí)，所述外源質(zhì)粒用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染攜帶有E1a基因和E1b基因的HEK細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染了該外源質(zhì)粒的HEK細(xì)胞中進(jìn)行待檢測(cè)rAAV的梯度稀釋，由待檢測(cè)rAAV提供野生型AAV基因組中決定其復(fù)制、包裝和整合所需的順式作用元件-基因組兩端的ITR序列，在所述轉(zhuǎn)染了該外源質(zhì)粒的HEK細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)rAAV的復(fù)制和增殖；然后通過檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)或檢測(cè)該細(xì)胞中復(fù)制和增殖產(chǎn)生的rAAV基因組拷貝數(shù)，計(jì)算待測(cè)rAAV的感染滴度。

8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述腺病毒中對(duì)rAAV包裝起輔助功能的基因包括編碼腺病毒E2a蛋白的基因、編碼腺病毒E4orf6蛋白的基因、編碼腺病毒VA RNA蛋白的基因。