[發明專利]一種利用質粒輔助進行rAAV感染滴度檢測的方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202011196673.0
• 申請日: 2020-10-30
• 公開（公告）號: CN112280801A
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發明（設計）人: 潘杏;何曉斌;劉光猛;張勝;賈寧;王夢蝶
• 申請（專利權）人: 武漢樞密腦科學技術有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/35;C12N15/34;C12Q1/6897;C12Q1/70;C12R1/93
• 代理公司: 武漢華之喻知識產權代理有限公司 42267
• 代理人: 彭翠;曹葆青

本發明屬于生物學領域，更具體地，涉及一種利用質粒輔助進行rAAV感染滴度檢測的方法及試劑盒。其通過對攜帶有E1a基因和E1b基因的HEK細胞瞬時轉染包含編碼AAV病毒Cap、Rep蛋白的基因質粒以及腺病毒輔助質粒的外源質粒，以該待測rAAV作為種子病毒，在轉染外源質粒的HEK細胞中實現rAAV的復制和增殖；通過檢測報告基因的表達或檢測該細胞中復制和增殖產生的的rAAV基因組拷貝數，計算待測rAAV的感染滴度，不需引入輔助病毒，通過質粒輔助即可高效簡單實現rAAV感染滴度的檢測，由此解決現有技術rAAV感染滴度檢測方法需要引入輔助病毒存在安全風險，且需要配合包裝特定細胞系操作復雜等技術問題。

技術領域

本發明屬于生物學領域，具體地，涉及一種利用質粒輔助進行rAAV感染滴度檢測的方法及試劑盒。

背景技術

腺病毒伴隨病毒(AAV)屬于細小病毒科，是一類小顆粒、復制缺陷、無包膜的單鏈DNA(ssDNA)病毒，通常需要腺病毒、皰疹病毒等輔助病毒的協助，才能進行復制。經人工改造的重組AAV(rAAV)具備安全性好、免疫原性低、組織嗜性廣泛、不整合到宿主細胞基因組等優點。近年來，用rAAV作基因治療載體已成為基因治療研究的熱點，并已有Glybera和Luxturna兩款藥物獲批上市，但rAAV作為基因治療載體也存在明顯缺點，首先其裝載外源基因的容量較小，裝載上限約為4.7kb，隨著裝載外源基因尺寸的增加，病毒顆粒包裝的完整性隨之下降；其次天然存在的諸如AAV1、AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9等多種血清型體內實驗雖對不同組織和細胞存在不同的感染偏好性和感染效率，但各種血清型AAV感染體外培養細胞效率整體偏低，研究者們嘗試對決定AAV血清型的蛋白衣殼進行改造，獲得諸如能夠感染多種細胞類型的AAVDJ血清型(Dirk Grimm et al.,2008)等多種血清型，但整體而言，AAV病毒感染體外培養細胞效率仍然較低，從而限制了AAV在細胞水平的各種實驗，如分子細胞篩選、感染滴度測定等。

在不加輔助病毒和其他輔助因子的情況下，對于體外培養細胞，AAV病毒感染效率一般較低。目前較常使用的促進AAV體外感染方法是通過腺病毒及單純皰疹病毒輔助AAV進行感染，這主要是因為AAV病毒的基因組為單鏈DNA(ssDNA)，進入細胞后必須變成雙鏈DNA(dsDNA)才能轉錄和翻譯外源基因，在沒有輔助病毒或其他輔助因子的情況下，AAV單鏈DNA在細胞內復制形成雙鏈DNA的過程很慢，而輔助病毒可以明顯促進單鏈DNA復制成雙鏈DNA，從而可以將外源基因的表達水平提高5-10倍。

研究表明也存在多種輔助因子能夠促進AAV感染體外培養的細胞。丁酸鹽是一種組蛋白去乙酰酶抑制因子，能誘導染色體的超乙酰化，從而導致沉默基因的誘導表水平。AAV體外感染細胞時也常使用10-50mM丁酸鈉作為促感染試劑，使外源基因的表達能夠提高5-10倍。zLLL(MG132)、LLnL(MG101)、bortezomib(硼替佐米)等蛋白酶體抑制劑(PI)通過抑制蛋白酶體對進入細胞中AAV的降解，也能夠一定程度促進AAV的體外細胞感染(Kristi Jet al.,2004；Anne M D et al.,2001；Paul E M et al.,2010；Jonathan D F et al.,2010)。另外，也有研究報道羥基脲(HU)、聚凝胺(Polybrene)、siRNA敲降核仁素以及使用微球體等方法也能在一定程度促進AAV的體外感染，但促進效果有限(Jarrod S J et al.,2009；Cathryn M et al.,2001)。