[發明專利]高效表達抗EGFR單克隆抗體細胞的篩選培養方法

在審

• 申請號: 202011192793.3
• 申請日: 2020-10-30
• 公開（公告）號: CN112391350A
• 公開（公告）日: 2021-02-23
• 發明（設計）人: 于紅陽;申陽陽;王紅麗;胡桂珍;楊仲璠;徐明波
• 申請（專利權）人: 北京雙鷺藥業股份有限公司;北京雙鷺立生醫藥科技有限公司;北京雙鷺生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N5/071;C07K16/28
• 代理公司: 北京知呱呱知識產權代理有限公司 11577
• 代理人: 孫志一

本發明實施例公開了一種高效表達抗EGFR單克隆抗體細胞的篩選培養方法，所述方法包括：將重組抗EGFR單克隆抗體的種子細胞復蘇，在Actipro基礎培養基中放大培養后得到種子細胞培養懸液，將所述種子細胞培養懸液接種，發酵培養，定期流加補料培養基和葡萄糖溶液，培養至細胞活率低于80％，收獲發酵培養液，得到所述高效表達抗EGFR單克隆抗體細胞培養液。本發明方法篩選高效分泌表達抗EGFR抗體的敲除巖藻糖轉移酶基因的CHO細胞系，使所表達的蛋白無巖藻糖修飾，以增強重組抗EGFR單抗的ADCC作用，增強其抗腫瘤效果，擴大適用人群。

技術領域

本發明實施例涉及生物技術領域，具體涉及一種高效表達抗EGFR單克隆抗體細胞的篩選培養方法。

背景技術

EGFR是一種相對分子質量為170kDa的跨膜糖蛋白，屬于HER/ErbB受體家族的酪氨酸激酶型受體。EGFR可以與表皮生長因子(EGF)、組織生長因子(TGF-α)等多種配體結合，二者結合后會使EGFR發生二聚化形成同源或異源二聚體，形成的二聚體發生交聯磷酸化反應，即一個受體使另外一個受體上特定酪氨酸殘基磷酸化，從而激活胞內區的酪氨酸激酶亞區，進而激發下一級信號傳導。EGFR的信號傳導關乎細胞的增殖、分化、凋亡、遷移和細胞周期循環，與腫瘤的形成和惡化息息相關。EGFR在75％的結直腸癌(CRC)患者體內都存在過表達，并且與預后不良相關，使其成為單克隆抗體治療的有吸引力的靶標。

目前，全球范圍內批準的抗表皮生長因子受體的單抗類藥物主要有西妥昔單抗、帕尼單抗和尼妥珠單抗，其中西妥昔單抗商品名愛必妥，是一種重組的人鼠嵌合型IgG1單抗，由SP2/0雜交瘤細胞表達，但SP2/0雜交瘤細作為宿主細胞表達的抗體含非人源“α(1,3)半乳糖結構”，臨床上發生嚴重的過敏反應，且西妥昔單抗在KRAS突變腫瘤患者中的作用不甚理想。一些證據表明，增強ADCC作用可直接提高該單抗的臨床療效。

ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)作用的改善可以通過使用具有糖基化修飾或Fc-結構域氨基酸序列改變的IgG來實現。體內外研究證實核心巖藻糖是影響ADCC活性最重要的糖基化結構。已有研究進一步證實與含有核心巖藻糖結構的單抗相比，無核心巖藻糖基化結構的單抗具有相對較高的FcγRIIIa結合能力及ADCC活性。

目前，在實際生產過程中，大約有90％由CHO細胞表達的重組IgG的Fc段都含有核心巖藻糖，為了提高抗體與FcγRIIIa之間的結合能力以及ADCC活性，采用多種方法降低重組IgG的巖藻糖基化修飾水平，包括采用敲除α-1,6巖藻糖基轉移酶基因或者使其低表達的細胞株，或者采用GnTIII高表達的細胞株(添加二分支N乙酰葡糖胺轉移酶會使核心巖藻糖含量下降)進行IgG的生產。

發明內容

為此，本發明實施例提供一種高效表達抗EGFR單克隆抗體細胞的篩選培養方法，以解決現有技術中重組抗EGFR單克隆抗體細胞的表達量較低、所表達的抗體蛋白存在巖藻糖修飾的問題。

為了實現上述目的，本發明實施例提供如下技術方案：

本發明提供一種高效表達抗EGFR單克隆抗體細胞的篩選培養方法，其特征在于，

所述方法包括：將重組抗EGFR單克隆抗體的種子細胞復蘇，在Actipro基礎培養基中放大培養后得到種子細胞培養懸液，將所述種子細胞培養懸液發酵培養，定期流加補料培養基和葡萄糖溶液，培養至細胞活率低于80％，收獲發酵培養細胞，得到所述高效表達抗EGFR單克隆抗體細胞。

優選的，所述發酵培養條件為：

在生物反應器中培養，初期培養溫度為37℃，pH值為7.0～7.2，培養液的溶氧量為40％～60％，轉速為150-250rpm，從發酵培養的96±2h開始，將培養溫度調至32-34℃，并添加補料培養基，發酵時間為13-15天，得到細胞培養發酵液。