[發明專利]一種高產四氫嘧啶工程菌株的構建方法與應用

在審

• 申請號: 202011191374.8
• 申請日: 2020-10-30
• 公開（公告）號: CN112280726A
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發明（設計）人: 康振;陳堅;堵國成;戴躍鋒;何廣文;顏少尉;魏偉偉
• 申請（專利權）人: 江南大學;湖南御家化妝品制造有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/54;C12N15/60;C12P17/12;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了一種高產四氫嘧啶工程菌株的構建方法與應用，屬于生物工程技術領域。本發明提供了能夠在低鹽條件下生產四氫嘧啶的E.coli BL21(DE3)重組菌，該菌包含由T7啟動子控制的、具有特定RBS序列的外源基因ectA，ectB和ectC，并使用sRNA技術對ptsG，pta，thrA和lysA基因進行了轉錄后水平抑制。本發明構建的重組大腸桿菌以葡萄糖為底物，發酵72h后，四氫嘧啶產量可達30g/L。

技術領域

本發明涉及一種高產四氫嘧啶工程菌株的構建方法與應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術

四氫嘧啶(Ectoine)是一種極性、易溶、生理pH范圍內不帶電荷的小分子有機物，屬于相容性溶質。研究表明，四氫嘧啶是好氧中度嗜鹽細菌中最常見的滲透壓調控物；對蛋白質的構象和活性有積極的影響；對細菌細胞處于極端環境(干旱、冷凍、高鹽堿、高溫、射線等)中的核酸、蛋白質、酶等起到保護作用；廣泛應用于醫藥，化妝品，酶工業等領域。

四氫嘧啶的合成主要有兩種方法：化學合成法和生物合成法。其中，生物合成法主要采用酶催化法和發酵法。化學合成法存在著很多問題，包括生產過程復雜，合成產率低，副產物多且與目標產物的化學性質相似，下游分離純化難度很高等。酶催化法，誘導表達并提取酶的過程操作復雜，成本較高。傳統發酵法常采用的是一種叫做“細菌擠奶”的方法，通過循環控制培養環境中鹽濃度的增加與降低來分別實現嗜鹽或耐鹽菌中四氫嘧啶的合成與分泌，該方法存在高鹽的發酵廢液對生產設備腐蝕嚴重，對環境壓力大等缺點。此外，謝希賢等(201510410080.2)公布了一種產生四氫嘧啶的大腸桿菌工程菌及其構建方法與應用，該基因工程菌為具有特定基因型的大腸桿菌，包含來源于伸長鹽單胞菌ectABC基因簇；lysA，thrA，iclR三個基因缺陷型；具有lac啟動子控制的谷氨酸棒狀桿菌lysC基因；trc啟動子控制的ppc基因；發酵20-28h后，四氫嘧啶產量達到了12-18g/L。但是，該菌未對異源基因簇ectABC做改造，在一定程度上限制了四氫嘧啶產量的進一步提高；同時該菌為氨基酸缺陷型菌，一定程度上會抑制菌體生長，給菌體造成一定的壓力，進而影響四氫嘧啶的生產。

發明內容

本發明的目的在于提供一種生產四氫嘧啶的大腸桿菌工程菌的構建方法和應用，用于制備四氫嘧啶。

本發明的第一個目的是提供一種生產四氫嘧啶的大腸桿菌工程菌，表達了伸長鹽單胞菌來源的EctABC基因簇，或伸長鹽單胞菌來源的二氨基丁酸轉乙酰基酶(EctA)、二氨基丁酸轉氨酶(EctB)和四氫嘧啶合成酶(EctC)，以及谷氨酸棒桿菌來源的天冬氨酸激酶，并替換了異源基因ectA,ectB,ectC的RBS序列。

在一種實施方式中，所述EctABC基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一種實施方式中，所述二氨基丁酸轉乙酰基酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第1～579bp所示。

在一種實施方式中，所述二氨基丁酸轉氨酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第662～1927bp所示。

在一種實施方式中，所述四氫嘧啶合成酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第2020～2433bp所示。

在一種實施方式中，所述二氨基丁酸轉乙酰基酶基因的RBS替換為SEQ ID NO.7第287～300bp所示序列、二氨基丁酸轉氨酶基因和和四氫嘧啶合成酶基因的RBS均替換為SEQID NO.8所示序列。

在一種實施方式中，所述天冬氨酸激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一種實施方式中，所述EctABC基因簇以載體pRSFDuet-1表達。

在一種實施方式中，所述基因工程菌以大腸桿菌為宿主。