[發(fā)明專利]一種高產(chǎn)四氫嘧啶工程菌株的構(gòu)建方法與應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011191374.8
• 申請(qǐng)日: 2020-10-30
• 公開（公告）號(hào): CN112280726A
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 康振;陳堅(jiān);堵國(guó)成;戴躍鋒;何廣文;顏少尉;魏偉偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué);湖南御家化妝品制造有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/70;C12N15/54;C12N15/60;C12P17/12;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽(yáng)光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

1.一種生產(chǎn)四氫嘧啶的大腸桿菌工程菌，其特征在于，表達(dá)了(a)或(b)，并表達(dá)了谷氨酸棒桿菌來(lái)源的天冬氨酸激酶；其中，

(a)伸長(zhǎng)鹽單胞菌來(lái)源的EctABC基因簇；

(b)編碼伸長(zhǎng)鹽單胞菌來(lái)源的二氨基丁酸轉(zhuǎn)乙?；浮⒍被∷徂D(zhuǎn)氨酶和四氫嘧啶合成酶的基因。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌工程菌，其特征在于，還替換了編碼二氨基丁酸轉(zhuǎn)乙?；傅幕騟ctA、編碼二氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶的基因ectB及編碼四氫嘧啶合成酶的基因ectC的RBS序列。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的大腸桿菌工程菌，其特征在于，以載體pRSFDuet-1表達(dá)所述基因。

4.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一所述的大腸桿菌工程菌，其特征在于，宿主為E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α或E.coli TOP10。

5.根據(jù)權(quán)利要求1～4任一所述的大腸桿菌工程菌，其特征在于，還抑制了ptsG，pta，thrA和lysA中至少一個(gè)基因的表達(dá)。

6.構(gòu)建權(quán)利要求1～5任一所述大腸桿菌工程菌的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)以線性化的質(zhì)粒pRSFDuet-1表達(dá)EctABC基因簇，獲得重組質(zhì)粒pR-ABC，并轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)得到重組菌株E/pR-ABC；

(2)分別替換pR-ABC上ectA，ectB和ectC基因的RBS序列，獲得重組質(zhì)粒R-AB，再將重組質(zhì)粒R-AB轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)，得到重組菌株ECT-AB；

(3)將天冬氨酸激酶基因連接至表達(dá)載體R-AB的第二個(gè)T7啟動(dòng)子表達(dá)框處，并對(duì)第932位氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，得到重組質(zhì)粒R-AB-L，再將重組質(zhì)粒R-AB-L轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)，得到重組菌株。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，在步驟(3)后，設(shè)計(jì)以micC為骨架靶向基因ptsG，pta，thrA或lysA的sRNA序列，合成并插入到質(zhì)粒R-AB-L中，得到重組質(zhì)粒R-AB-L-micC，再轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)中。

8.權(quán)利要求1～5任一所述的大腸桿菌工程菌在制備四氫嘧啶或含四氫嘧啶的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

9.一種生產(chǎn)四氫嘧啶的方法，其特征在于，將權(quán)利要求1～5任一所述的大腸桿菌工程菌在含酵母提取物、蛋白胨、KH₂PO₄、Na₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄、FeSO₄、葡萄糖的培養(yǎng)基中發(fā)酵。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵在28～37℃下進(jìn)行；

可選地，控制發(fā)酵體系的溶解氧維持在25-35％，控制pH維持在7.0-7.2。