[發明專利]規模化生產凝血酶調節蛋白的方法

在審

• 申請號: 202011191131.4
• 申請日: 2020-10-30
• 公開（公告）號: CN112266415A
• 公開（公告）日: 2021-01-26
• 發明（設計）人: 侯曉彥;宗揚;許冬志;傅和亮;沈小寧;薛云杰;陳玨敏
• 申請（專利權）人: 江蘇艾迪藥業股份有限公司
• 主分類號: C07K14/745
• 分類號: C07K14/745;C07K1/22;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/16
• 代理公司: 揚州潤中專利代理事務所(普通合伙) 32315
• 代理人: 謝東

本發明公開了一種規模化生產凝血酶調節蛋白的方法。該規模化生產凝血酶調節蛋白的方法包括將凝血酶調節蛋白粗制品經過陰離子交換層析柱、親和層析柱A、復合型親和層析柱B、凝血酶親和層析柱和疏水層析柱層析，收集洗脫峰，超濾濃縮得到凝血酶調節蛋白精制品。本發明以凝血酶調節蛋白粗制品為原料，篩選多種商品化的生產型親和層析柱、疏水層析柱等進行條件優化，確定對目標蛋白有純化效果、操作簡便、易于放大的層析填料，最終確定一種規模化生產凝血酶調節蛋白的方法，提高純化倍數，有利于凝血酶調節蛋白精制品的規模化生產。

技術領域

本發明涉及蛋白分離提取技術領域，尤其是涉及規模化生產凝血酶調節蛋白的方法。

背景技術

人溶解型凝血酶調節蛋白(Thrombomodulin，簡稱TM)主要存在于人血漿和人尿液中，是由557個氨基酸殘基構成的糖蛋白，分子量約為60,300D，等電點約為3.8，最初由N.L.Esmon等于1981年在實驗中發現，其結構包括一個氨基端的植物凝集樣結構域，6個重復排列的內皮生長因子(endothelial growth factor，EGF)樣結構域，一個絲氨酸/蘇氨酸富集區(疏水區域)，一個跨膜區和一個短的細胞內尾端。臨床上TM主要用于凝血系統紊亂而致的彌散性血管內凝血(DIC)。

1993年，已有文獻報道可以從尿液中分離純化TM。例如Yamamoto等純化TM的過程使用了QAE交聯葡聚糖，抗TM單克隆抗體柱，凝血酶作為配體的親和柱和交聯葡聚糖G-200，但由于此方法需要制備單克隆抗體，過程較為復雜。再如D.E.Jackson等純化TM時結合使用了DEAE瓊脂糖凝膠，凝血酶作為配體的親和柱和反向HPLC，此方法中反向HPLC產量低且不適于大規模純化，另外，Aoki等(日本專利申請公開No.Sho-63-30423)和Kunihiro等(日本專利申請公開No.Sho-63-218399)報道了從新鮮尿液中純化TM的方法，使用了離子交換色譜，凝血酶結合的親和柱和凝膠滲透，結果證明當TM含量很低時，此方法不適用。綜上可以看出目前從人尿中提取TM的各種純化方法均表現為產量低且不適于大規模工業化生產，尋找適于工業化放大生產的分離純化技術，實現規模化、高純度的尿蛋白TM生產，成為亟待解決的問題。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術存在的不足，提供規模化生產凝血酶調節蛋白的方法，適于工業化放大生產凝血酶調節蛋白。

為實現上述目的，本發明規模化生產凝血酶調節蛋白的方法采用的技術方案是：

一種規模化生產凝血酶調節蛋白的方法，包括將凝血酶調節蛋白粗制品經過陰離子交換層析柱、親和層析柱A、復合型親和層析柱B、凝血酶親和層析柱和疏水層析柱層析，收集洗脫峰，超濾濃縮得到凝血酶調節蛋白精制品。

所述凝血酶調節蛋白粗制品是指經過硫酸銨沉淀的，比活性不低于1.0ug/E280的粗制品，上樣前，超濾濃縮，調節pH為6.0-9.0，電導0.2-2mS/cm。

陰離子交換層析柱平衡緩沖液平衡后，上樣凝血酶調節蛋白粗品，沖洗液沖洗，洗脫液洗脫，收集樣品洗脫液，平衡緩沖液為0.05-0.25mol/L磷酸鹽緩沖液或Tris緩沖液，含0-0.1MNaCl，pH為6.0-9.0，沖洗液為0.05-0.25mol/L磷酸鹽或者醋酸鹽緩沖液，含0.1-0.3mol/L NaCl，pH為6.0-9.0，洗脫液為0.10-0.30mol/L磷酸鹽緩沖液或醋酸鹽緩沖液，含0.1-0.5MNaCl，pH為5.0-6.0。

作為優選，平衡液為0.10mol/L磷酸鹽，含0.05MNaCl，pH為6.0，洗脫液為0.20M醋酸鹽緩沖液，含0.4MNaCl，pH為5.0。沖洗液為0.15mol/L磷酸鹽緩沖液，含0.2mol/L NaCl，pH為6.0。

凝血酶調節蛋白粗制品的上樣液中以及陰離子交換層析柱純化過程中的平衡緩沖溶液中均加入蛋白保護劑。作為優選，蛋白保護劑為10-20mM芐脒鹽酸鹽或10-25g/L甘露醇/甘氨酸。