[發(fā)明專利]規(guī)模化生產(chǎn)凝血酶調(diào)節(jié)蛋白的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011191131.4
• 申請(qǐng)日: 2020-10-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112266415A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-01-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 侯曉彥;宗揚(yáng);許冬志;傅和亮;沈小寧;薛云杰;陳玨敏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇艾迪藥業(yè)股份有限公司
• 主分類號(hào): C07K14/745
• 分類號(hào): C07K14/745;C07K1/22;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/16
• 代理公司: 揚(yáng)州潤(rùn)中專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32315
• 代理人: 謝東

1.一種規(guī)模化生產(chǎn)凝血酶調(diào)節(jié)蛋白的方法，其特征在于：包括將凝血酶調(diào)節(jié)蛋白粗制品經(jīng)過(guò)陰離子交換層析柱、親和層析柱A、復(fù)合型親和層析柱B、凝血酶親和層析柱、疏水層析柱層析，收集洗脫峰，超濾濃縮得到凝血酶調(diào)節(jié)蛋白精制品。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述模化生產(chǎn)凝血酶調(diào)節(jié)蛋白的方法，其特征在于：所述凝血酶調(diào)節(jié)蛋白粗制品是指經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀的，比活性不低于1.0ug/E280的粗制品，上樣前，超濾濃縮，調(diào)節(jié)pH為6.0-9.0，電導(dǎo)0.2-2mS/cm。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述模化生產(chǎn)凝血酶調(diào)節(jié)蛋白的方法，其特征在于：陰離子交換層析柱平衡緩沖液平衡后，上樣凝血酶調(diào)節(jié)蛋白粗品，沖洗液沖洗，洗脫液洗脫，收集樣品洗脫液，平衡緩沖液為0.05-0.25mol/L磷酸鹽緩沖液或Tris緩沖液，含0-0.1MNaCl，pH為6.0-9.0，沖洗液為0.05-0.25mol/L磷酸鹽或者醋酸鹽緩沖液，含0.1-0.3mol/LNaCl，pH為6.0-9.0，洗脫液為0.10-0.30mol/L磷酸鹽緩沖液或醋酸鹽緩沖液，含0.1-0.5MNaCl，pH為5.0-6.0。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述模化生產(chǎn)凝血酶調(diào)節(jié)蛋白的方法，其特征在于：凝血酶調(diào)節(jié)蛋白粗制品的上樣液中以及陰離子交換層析柱純化過(guò)程中的平衡緩沖溶液中均加入蛋白保護(hù)劑。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述模化生產(chǎn)凝血酶調(diào)節(jié)蛋白的方法，其特征在于：陰離子交換層析柱層析后的樣品洗脫液經(jīng)過(guò)10-30kDa超濾膜超濾，調(diào)節(jié)pH為5.0-8.0，電導(dǎo)低于平衡液電導(dǎo)2-3mS/cm，上樣平衡好的親和層析柱A柱層析純化，平衡液為0.02-0.2mol/L醋酸鹽或磷酸鹽緩沖液，所述磷酸鹽緩沖液含0-0.5mol/LNaCl，pH為4.0-7.0，收集樣品穿透液。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述模化生產(chǎn)凝血酶調(diào)節(jié)蛋白的方法，其特征在于：所述親和層析柱A配基是是活性染料的復(fù)合型親和柱，活性染料為Blue sepharose 6Fast Flow、AF Red-650ML。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述模化生產(chǎn)凝血酶調(diào)節(jié)蛋白的方法，其特征在于：親和層析柱A的樣品穿透液經(jīng)過(guò)10-30kDa超濾膜超濾，調(diào)節(jié)pH為5.0-8.0，電導(dǎo)低于平衡液電導(dǎo)2-3mS/cm，上樣平衡液平衡好的復(fù)合型親和層析柱B層析純化，上樣結(jié)束后用pH為5.0-8.0的平衡液沖洗，然后沖洗液繼續(xù)沖洗，最后用洗脫液洗脫，收集樣品洗脫液，平衡液為含有0-0.1M NaCl的0.05M磷酸鹽緩沖液；沖洗液為pH4.0-6.0的0.05M醋酸鹽緩沖液，沖洗液含有0-0.2mol/L的氯化鈉；洗脫液pH為4.0-6.0的0.05M醋酸鹽緩沖液，洗脫液中含有0.1-0.5M NaCl。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述模化生產(chǎn)凝血酶調(diào)節(jié)蛋白的方法，其特征在于：所述復(fù)合型親和層析柱B是以苯甲脒為配基的復(fù)合型親和層析柱。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述模化生產(chǎn)凝血酶調(diào)節(jié)蛋白的方法，其特征在于：采用平衡好的凝血酶親和層析柱，上樣復(fù)合型親和層析柱B層析后的樣品洗脫液，上樣前調(diào)節(jié)pH5.0-8.0，上樣后利用沖洗液沖洗，最后用洗脫液洗脫，收集樣品洗脫液，平衡液為pH5.0-8.0，0.02-0.2M醋酸或Tirs緩沖鹽，含有0-0.08MNaCl，沖洗液為pH5.0-8.0，0.02-0.2M醋酸或Tirs緩沖鹽，含有0.05-0.15MNaCl，洗脫液為pH5.0-8.0，0.02-0.2M醋酸或Tirs緩沖鹽，含有0.2-1.0MNaCl。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述模化生產(chǎn)凝血酶調(diào)節(jié)蛋白的方法，其特征在于：所述凝血酶親和層析柱配基是凝血酶，凝血酶為源于人血漿、牛血漿、豬血漿和細(xì)胞表達(dá)重組型凝血酶。