[發明專利]一種篩選GPR109A受體激動劑的細胞模型及篩選方法

在審

• 申請號: 202011188737.2
• 申請日: 2020-10-30
• 公開（公告）號: CN112680418A
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發明（設計）人: 付守鵬;冉鑫;柳巨雄;楊元溪;侯爽;渠玉華
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12Q1/66
• 代理公司: 北京棘龍知識產權代理有限公司 11740
• 代理人: 戴麗偉

本發明公開了一種篩選GPR109A受體激動劑的細胞模型以及篩選方法，包括以下步驟，(1)構建含有人GPR109A受體基因的慢病毒表達載體；(2)將慢病毒表達載體轉染至正常的293T細胞；(3)篩選穩定高表達GPR109A受體的細胞株；(4)通過雙熒光素酶檢測CRE轉錄活性，尋找GPR109A受體激動劑。本發明的篩選方法通過高表達GPR109A的293T細胞株與空轉對照的293T細胞株實驗結果的對比大大降低了假陽性結果，提高了篩選的準確性，可行度高，并且穩定準確，可以準確有效地篩選GPR109A受體激動劑，具有良好地應用前景。

技術領域

本發明涉及細胞生物學技術領域，具體為一種篩選GPR109A受體激動劑的細胞模型以及篩選方法。

背景技術

GPR109A,又稱為羥基羧酸受體2(hydroxycarboxylic acid receptor 2,HCA2),在人體內被稱為HM-74a,在鼠上被稱為PUMA-G。GPR109A受體為G蛋白偶聯受體，它作為膜受體可接受膜外配體的激活后發揮信號轉導作用。目前已有大量研究表明GPR109A受體在脂肪細胞、巨噬細胞、小膠質細胞等多種細胞、組織以及器官中發揮重要功能。在多項研究中已證明GPR109A具有抗炎癥、抗腫瘤、抗高血脂以及改善動脈粥樣硬化的作用。

G蛋白偶聯受體(GPRC)為具有七個α螺旋的跨膜蛋白受體，跨膜蛋白的特點為，其肽鏈由胞外N端(ECD),7個跨膜α螺旋區域(TM1-TM7,HD)，以及胞內C端(ICL)共同組成。GPRC位于細胞膜內的外周蛋白一般具有與膜受體偶聯的異源三聚體，由G_α，G_β和G_γ組成。而三種亞基類型和組合方式的不同則會引起不同的生物效應。根據特性將GPRC分為：G_S，G_i/o和G_12/13。

配體結合G_i/o蛋白偶聯受體后，可抑制腺苷酸環化酶(AC)的激活，從而降低細胞內CAMP的含量，而CAMP可激活下游蛋白激酶(PKA)，PKA主要功能為磷酸化轉錄因子CAMPbinding protein(CREB),而后磷酸化的CREB可結合特定的啟動子CAMP response element(CRE)。

已有充分證據表明，GPR109A屬于G_i/o蛋白偶聯受體，配體激活GPR109A受體后，可使細胞內CAMP含量減少，從而發揮抗炎與調節脂肪代謝等作用。

本發明中，采用雙熒光素酶的方法檢測啟動子CRE的轉錄活性，通過CRE的轉錄活性反應細胞內CAMP的含量。因為GPR109A由配體激活后抑制CAMP的特性，導致CRE轉錄活性在處理組與未處理細胞中表現一致，因此需提前加入AC激動劑(Forskolin)，提高細胞內CAMP濃度，從而更準確的反應GPR109A的激活特性。

本發明的細胞模型中，由于高表達了GPR109A受體，在GPR109A受體被激活后會出現明顯的CAMP下降，從而通過雙熒光素酶檢測技術可發現顯著的CRE轉錄活性降低的現象。隨后通過與正常293T細胞的對比，可進一步篩選GPR109A受體的配體。

近年來，國內外關于GPR109A及其已確定配體如丁酸和煙酸等的相關研究越來越多，但迄今尚未見有關篩選GPR109A受體配體的細胞模型與篩選方法的建立。

發明內容

(一)解決的技術問題

針對現有技術的不足，本發明提供了一種篩選GPR109A受體激動劑的細胞模型及篩選方法，以解決上述問題。

(二)技術方案