[發明專利]一種篩選GPR109A受體激動劑的細胞模型及篩選方法

在審

• 申請號: 202011188737.2
• 申請日: 2020-10-30
• 公開（公告）號: CN112680418A
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發明（設計）人: 付守鵬;冉鑫;柳巨雄;楊元溪;侯爽;渠玉華
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12Q1/66
• 代理公司: 北京棘龍知識產權代理有限公司 11740
• 代理人: 戴麗偉

1.一種篩選GPR109A受體激動劑的細胞模型，包括以下步驟，其特征在于：(1)構建含有人GPR109A受體基因的慢病毒表達載體；(2)將慢病毒表達載體轉染至正常的293T細胞；(3)篩選穩定高表達GPR109A受體的細胞株；(4)通過雙熒光素酶檢測CRE轉錄活性，尋找GPR109A受體激動劑。

2.根據權利要求1所述的一種篩選GPR109A受體激動劑的細胞模型，其特征在于：其中步驟(1)中所述GPR109A的基因序列號為NM_177551.4。

3.根據權利要求1所述的一種篩選GPR109A受體激動劑的細胞模型，其特征在于：其中步驟(1)中的病毒載體由pLVX-shRNA2-T2A-puro shRNA表達載體、psPAX2和p MD2.G三質粒系統形成，成功構建PCDH-CMV-GPR109A-EF1-copGFP-puro慢病毒。

4.根據權利要求1所述的一種篩選GPR109A受體激動劑的細胞模型，其特征在于：其中步驟(2)中使用細胞種植六孔板第二天后，細胞密度達到約60％，進行病毒感染的操作，六孔板內加入終濃度為10ug/ml的polybrene的培養基1.9ml，慢病毒取100ul，加入6孔板內，搖晃混勻，轉入CO₂孵箱繼續培養。

5.根據權利要求1所述的一種篩選GPR109A受體激動劑的細胞模型，其特征在于：其中步驟(3)中對轉染完成細胞使用含Puromycin 1ug/ml的培養基，進行細胞傳代并持續加藥。

6.根據權利要求1所述的一種篩選GPR109A受體激動劑的細胞模型，其特征在于：在步驟(3)中所采用的GPR109A上下游引物分別為TGAGGCAGAGACAGATGGACAGAC與GAGAAGCCAGAAGATGCGGATGC，Western blot所使用的GPR109A蛋白一抗濃度為1：3000。

7.根據權利要求1所述的一種篩選GPR109A受體激動劑的細胞模型，現提供一種篩選GPR109A受體激動劑的方法，其特征在于，包括：A將步驟(3)中的細胞株以10⁵個/ml的密度傳代于96孔板內，培養24h，待細胞密度達60％后，換非完全DMEM培養基；

B在加入非完全培養基4h后，加入DMSO與從CAMP激動劑(Forskolin)，在6h后加入報告基因質粒pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro]、內參質粒PRL-TK共轉染，6h后換液，待換液后24h-36h通過雙熒光素酶技術檢測CRE轉錄活性；

C在加入非完全培養基4h后，加入待測化合物處理0.5h-1h,加入CAMP激動劑(Forskolin)，在6h后加入報告基因質粒pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro]、內參質粒PRL-TK共轉染，6h后換液，待換液后24h-36h通過雙熒光素酶技術檢測CRE轉錄活性。

8.根據權利要求7所述的一種篩選GPR109A受體激動劑的方法，其特征在于：在步驟B中所用細胞為高表達GPR109A的293T細胞株與空轉對照的293T細胞株，Forskolin濃度為5μM與10μM，作用時間為6h。

9.根據權利要求7所述的一種篩選GPR109A受體激動劑的方法，其特征在于：步驟C中待測化合物及其濃度為：1mM丁酸、1mM煙酸和1mMβ-羥丁酸，所用Forskolin濃度5μM，作用時間6h。

10.根據權利要求7所述的一種篩選GPR109A受體激動劑的方法，其特征在于：在步驟B與步驟C中轉染質粒選用的轉染試劑為lip2000，轉染時DNA與lip2000的比例為1：2.5。