[發(fā)明專利]一種篩選GPR109A受體激動劑的細(xì)胞模型及篩選方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202011188737.2
• 申請日: 2020-10-30
• 公開（公告）號: CN112680418A
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 付守鵬;冉鑫;柳巨雄;楊元溪;侯爽;渠玉華
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12Q1/66
• 代理公司: 北京棘龍知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11740
• 代理人: 戴麗偉

1.一種篩選GPR109A受體激動劑的細(xì)胞模型，包括以下步驟，其特征在于：(1)構(gòu)建含有人GPR109A受體基因的慢病毒表達(dá)載體；(2)將慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至正常的293T細(xì)胞；(3)篩選穩(wěn)定高表達(dá)GPR109A受體的細(xì)胞株；(4)通過雙熒光素酶檢測CRE轉(zhuǎn)錄活性，尋找GPR109A受體激動劑。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種篩選GPR109A受體激動劑的細(xì)胞模型，其特征在于：其中步驟(1)中所述GPR109A的基因序列號為NM_177551.4。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種篩選GPR109A受體激動劑的細(xì)胞模型，其特征在于：其中步驟(1)中的病毒載體由pLVX-shRNA2-T2A-puro shRNA表達(dá)載體、psPAX2和p MD2.G三質(zhì)粒系統(tǒng)形成，成功構(gòu)建PCDH-CMV-GPR109A-EF1-copGFP-puro慢病毒。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種篩選GPR109A受體激動劑的細(xì)胞模型，其特征在于：其中步驟(2)中使用細(xì)胞種植六孔板第二天后，細(xì)胞密度達(dá)到約60％，進(jìn)行病毒感染的操作，六孔板內(nèi)加入終濃度為10ug/ml的polybrene的培養(yǎng)基1.9ml，慢病毒取100ul，加入6孔板內(nèi)，搖晃混勻，轉(zhuǎn)入CO₂孵箱繼續(xù)培養(yǎng)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種篩選GPR109A受體激動劑的細(xì)胞模型，其特征在于：其中步驟(3)中對轉(zhuǎn)染完成細(xì)胞使用含Puromycin 1ug/ml的培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞傳代并持續(xù)加藥。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種篩選GPR109A受體激動劑的細(xì)胞模型，其特征在于：在步驟(3)中所采用的GPR109A上下游引物分別為TGAGGCAGAGACAGATGGACAGAC與GAGAAGCCAGAAGATGCGGATGC，Western blot所使用的GPR109A蛋白一抗?jié)舛葹?：3000。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種篩選GPR109A受體激動劑的細(xì)胞模型，現(xiàn)提供一種篩選GPR109A受體激動劑的方法，其特征在于，包括：A將步驟(3)中的細(xì)胞株以10⁵個/ml的密度傳代于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24h，待細(xì)胞密度達(dá)60％后，換非完全DMEM培養(yǎng)基；

B在加入非完全培養(yǎng)基4h后，加入DMSO與從CAMP激動劑(Forskolin)，在6h后加入報告基因質(zhì)粒pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro]、內(nèi)參質(zhì)粒PRL-TK共轉(zhuǎn)染，6h后換液，待換液后24h-36h通過雙熒光素酶技術(shù)檢測CRE轉(zhuǎn)錄活性；

C在加入非完全培養(yǎng)基4h后，加入待測化合物處理0.5h-1h,加入CAMP激動劑(Forskolin)，在6h后加入報告基因質(zhì)粒pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro]、內(nèi)參質(zhì)粒PRL-TK共轉(zhuǎn)染，6h后換液，待換液后24h-36h通過雙熒光素酶技術(shù)檢測CRE轉(zhuǎn)錄活性。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種篩選GPR109A受體激動劑的方法，其特征在于：在步驟B中所用細(xì)胞為高表達(dá)GPR109A的293T細(xì)胞株與空轉(zhuǎn)對照的293T細(xì)胞株，F(xiàn)orskolin濃度為5μM與10μM，作用時間為6h。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種篩選GPR109A受體激動劑的方法，其特征在于：步驟C中待測化合物及其濃度為：1mM丁酸、1mM煙酸和1mMβ-羥丁酸，所用Forskolin濃度5μM，作用時間6h。

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種篩選GPR109A受體激動劑的方法，其特征在于：在步驟B與步驟C中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒選用的轉(zhuǎn)染試劑為lip2000，轉(zhuǎn)染時DNA與lip2000的比例為1：2.5。