[發明專利]用于檢測慢性淋巴細胞白血病耐藥相關基因突變的數字PCR試劑盒及引物和探針

有效

• 申請號: 202011186910.5
• 申請日: 2020-10-30
• 公開（公告）號: CN114438179B
• 公開（公告）日: 2023-06-13
• 發明（設計）人: 繆祎;李建勇;顧丹靈;朱華淵;謝立群;肖曉;趙培培;劉以哲;熊慧
• 申請（專利權）人: 江蘇省人民醫院（南京醫科大學第一附屬醫院）;蘇州云泰生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 北京和信華成知識產權代理事務所(普通合伙) 11390
• 代理人: 郝亮

本發明涉及生物檢測領域，具體講，涉及一種用于檢測慢性淋巴細胞白血病(CLL)耐藥相關基因突變的數字PCR試劑盒及引物和探針。本發明的試劑盒中含有用于檢測BTK?C481S位點、PLCG2?R655W位點、S707Y位點、BCL2?G101V位點和F104L位點的突變的引物和探針。本發明試劑盒采用數字PCR技術，對人類BTK?C481S等突變位點進行定量檢測，為臨床醫生對CLL患者靶向用藥的療效監測及臨床用藥提供參考。

技術領域

本發明涉及生物檢測領域，具體講，涉及一種用于檢測慢性淋巴細胞白血病耐藥相關基因突變的數字PCR試劑盒及引物和探針。

背景技術

慢性淋巴細胞白血病(CLL)是一種以成熟的、CD5陽性的B細胞在外周血、骨髓、肝脾和淋巴結中克隆性增殖積累為特征的血液系統惡性疾病，是西方國家最常見的成人白血病。CLL患者的中位年齡為72歲，男性較女性更易感。我國CLL發病率雖然低于西方國家，但隨著人口老齡化、生活方式西化以及診斷技術的提高，發病率呈現上升趨勢。近30年來，CLL的治療逐漸從免疫化療走向靶向治療時代，多種新型靶向藥物投入臨床應用，包括布魯頓酪氨酸激酶(BTK)抑制劑伊布替尼(Ibrutinib)、PI3K抑制劑艾代拉里斯(Idelalisib)和Bcl-2抑制劑維奈克拉(Venetoclax)等。

B細胞受體(BCR)信號傳導通路的持續活化在CLL細胞的增殖和生存中起到了重要的調控作用，阻斷或抑制BCR通路是治療CLL的新策略。BTK是BCR信號通路的重要組成部分之一，是B細胞成熟、分化、增殖及生存通路的重要調控因子。在CLL中，BTK可通過激活NF-κB、MAP激酶等下游信號通路，促進CLL細胞生存。抑制BTK活性能夠下調BCR下游信號通路，使CLL細胞發生凋亡，產生明顯的抗腫瘤效應。因此，靶向BTK的藥物治療策略已然成為血液系統惡性腫瘤的研究熱點。

伊布替尼是國際上第一個獲批應用于治療CLL患者的BTK抑制劑，它通過與BTK活性位點上的半胱氨酸-481(C481)高度特異性共價結合，不可逆地抑制BTK的活性，抑制B淋巴細胞的增殖、趨化和粘附，從而發揮良好的抗腫瘤作用，是一種高效、高選擇性的口服小分子BTK抑制劑。伊布替尼在2017年獲得我國藥品監督管理局批準用于治療復發或難治CLL。

然而，在伊布替尼的臨床應用過程中，CLL患者對伊布替尼耐藥的現象被發現并重視。多項研究發現，伊布替尼獲得性耐藥的產生與伊布替尼與BTK共價結合位點的基因突變(如C481S突變)、BTK下游通路調控因子突變(如PLCG2基因R665W突變、L846F突變和S707Y突變)有關。其中，BTK?C481S突變對伊布替尼耐藥性的產生起到最主要的作用。有研究發現，CLL患者外周血中BTK?C481S突變的克隆擴增早于伊布替尼臨床耐藥表現9.3個月出現，定期監測、及時調整用藥能使患者生存獲益。目前，臨床中多采用二代測序技術對CLL患者生物學樣本進行靶向基因檢測，以選擇最適治療方案、實現精準化治療。但是，經濟成本高、檢測周期長成為二代測序技術服務于CLL患者臨床用藥指導的絆腳石。因此，低成本、高精度的快速檢測技術對于采用伊布替尼治療的CLL患者實現精準監測、指導臨床用藥有著非常重要的價值。

鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的首要發明目的在于提供一種用于檢測慢性淋巴細胞白血病耐藥相關基因突變的數字PCR試劑盒。

本發明的第二發明目的在于提供該試劑盒的使用方法。

本發明的第三發明目的在于提供用于檢測慢性淋巴細胞白血病耐藥相關基因突變的引物和探針。

為了完成本發明的發明目的，采用的技術方案為：

本發明提出一種用于檢測慢性淋巴細胞白血病耐藥相關基因突變的數字PCR試劑盒，所述試劑盒中含有核酸擴增試劑，所述核酸擴增試劑中含有用于檢測BCL2?G101V和F104L位點、PLCG2?R655W位點、PLCG2?S707Y位點、BTK?C481S位點的突變的引物和探針。