[發(fā)明專(zhuān)利]百日咳菌毛蛋白的純化方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011186126.4
• 申請(qǐng)日: 2020-10-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112341528A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-02-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊曉明;楊柏峰;田聰;潘聰;胡源;霍夢(mèng)穎;陳雯;胡太平;施斌;李新國(guó);段凱;朱德武
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/235
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/235;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/18;C07K1/20;C07K1/22;A61K39/10;A61P31/04
• 代理公司: 北京市誠(chéng)輝律師事務(wù)所 11430
• 代理人: 范盈

本發(fā)明涉及一種百日咳菌毛蛋白的純化方法，所述方法包括以下步驟：(1)百日咳菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后離心收集沉淀，尿素或其他適宜方法裂解菌體后得到PRN粗純液，經(jīng)層析后收集流穿液；(2)采用鹽析級(jí)聯(lián)疏水陰離子層析菌毛蛋白(Fim)粗純液；(3)調(diào)節(jié)步驟(2)中收集的菌毛蛋白(Fim)粗純液pH和電導(dǎo)，過(guò)CHT層析柱洗脫收集得到Fim抗原。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的，涉及一種百日咳菌毛蛋白的純化方法。

背景技術(shù)

百日咳(pertussis,whooping cough)是由革蘭氏陰性桿菌B.pertussis引起的一種對(duì)嬰幼兒危害極大的烈性呼吸道傳染病。疫苗接種前該疾病在全世界流行，其發(fā)病率和死亡率都很高。全細(xì)胞百日咳疫苗(whole cell pertussis vaccine,wPV)的接種使該疾病得到了良好的控制，但因接種后引起的較高不良反應(yīng)，逐漸被更安全的無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaccine aPV)所取代。2010年以來(lái)，在疫苗覆蓋率很高的國(guó)家，成人和青少年百日咳發(fā)病率上升，這些感染的成人和青少年作為傳播者，將病原體傳播給因年齡太小而無(wú)法接種疫苗的易感嬰幼兒，因此有學(xué)者大膽預(yù)言百日咳“重現(xiàn)”已經(jīng)來(lái)臨。研究人員進(jìn)行大量的回顧性研究發(fā)現(xiàn)，該疾病重現(xiàn)大致有如下原因：aPV效力的快速下降、疾病預(yù)防意識(shí)的增強(qiáng)、檢測(cè)方法的提高和在疫苗選擇壓力下的菌株變異等。特別在美國(guó)、澳大利亞、日本和歐洲等國(guó)，都出現(xiàn)了不表達(dá)百日咳黏附素(PRN)的臨床分離株。我國(guó)近幾年百日咳病例數(shù)也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，2017年全國(guó)共報(bào)告病例10390例，2018年22466例，在山東和深圳等地也相繼分離出不表達(dá)PRN或者具有耐藥性的百日咳臨床株。接種百日咳疫苗是預(yù)防百日咳最經(jīng)濟(jì)和最有效的方法，WHO已經(jīng)推薦成人或者孕期婦女可加強(qiáng)接種一劑百日咳疫苗，來(lái)應(yīng)對(duì)百日咳“重現(xiàn)”。目前國(guó)內(nèi)上市的國(guó)產(chǎn)aPV都是利用共純化法(co-purified)純化出百日咳抗原溶液(主要是PT和FHA)，經(jīng)脫毒劑處理后吸附鋁佐劑而成，進(jìn)口的aPV是利用技術(shù)更先進(jìn)的柱層析法單獨(dú)純化抗原后吸附鋁佐劑制成。

百日咳桿菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生百日咳毒素(pertussis toxin，PT)、絲狀血凝素(filamentous hemagglutinin，F(xiàn)HA))、PRN、Fim、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、腺苷酸環(huán)化酶毒素(adenylate cyclase toxin，ACT)、皮膚壞死毒素(dermonecrotictoxin，DNT)等十幾種抗原，主流aPV疫苗主要以PT和FHA為主。鑒于百日咳疾病“再現(xiàn)”，迫切需要改進(jìn)現(xiàn)有百日咳疫苗，WHO也推薦在現(xiàn)有aPV中添加Fim抗原，批準(zhǔn)用于人用疫苗，其濃度為5μg/劑量，被認(rèn)為是當(dāng)前五組分制品的重要組成部分。Fim稱(chēng)為菌毛，是B.pertussis細(xì)菌表面的一種絲狀聚合蛋白，有助于細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的粘附，主要有Fim2和Fim3兩種血清型。有兩個(gè)強(qiáng)有力的數(shù)據(jù)支持在疫苗配方中加入Fim2/3抗原，會(huì)使缺乏Fim2/3的百日咳桿菌突變體不能在小鼠氣管處定植，二是Fim抗體干擾百日咳桿菌對(duì)人肺泡上皮細(xì)胞系的粘附。在小鼠鼻內(nèi)挑戰(zhàn)模型中，腹腔注射10μg/劑量的Fim蛋白可阻止百日咳桿菌在小鼠肺部定植，在三組分aP疫苗中添加Fim2/3可提高其效力。賽洛菲巴斯德生產(chǎn)的五組分百日咳疫苗含有PT、FHA、PRN和Fim抗原，每劑Fim2/3含量是5μg。人類(lèi)臨床試驗(yàn)中，五組分aPV比二組分或三組分疫苗更有效，這表明Fim2/3的加入提高了aPV疫苗的有效性。

中國(guó)食品藥品檢定研究所的公開(kāi)號(hào)CN101074442A的專(zhuān)利申請(qǐng)是用基因工程方法從百日咳CS菌株中克隆Fim2和Fim3基因，利用表達(dá)載體獲得原核表達(dá)重組蛋白。

薛平的公開(kāi)號(hào)CN101507814B的專(zhuān)利申請(qǐng)通過(guò)收獲菌體沉淀，用去氧膽酸鈉磷酸鹽緩液裂解細(xì)胞，之后通過(guò)鹽析、浸提、再鹽析、浸提、透析、蔗糖密度梯度離心、戊二醛脫毒、再透析、超聲處理得到多組分細(xì)胞結(jié)構(gòu)性抗原。此方法生產(chǎn)周期長(zhǎng)，生產(chǎn)成本較高。