[發明專利]百日咳菌毛蛋白的純化方法在審
| 申請號： | 202011186126.4 | 申請日： | 2020-10-29 |
| 公開（公告）號： | CN112341528A | 公開（公告）日： | 2021-02-09 |
| 發明（設計）人： | 楊曉明;楊柏峰;田聰;潘聰;胡源;霍夢穎;陳雯;胡太平;施斌;李新國;段凱;朱德武 | 申請（專利權）人： | 武漢生物制品研究所有限責任公司 |
| 主分類號： | C07K14/235 | 分類號： | C07K14/235;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/18;C07K1/20;C07K1/22;A61K39/10;A61P31/04 |
| 代理公司： | 北京市誠輝律師事務所 11430 | 代理人： | 范盈 |
| 地址： | 430207 湖北省*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 百日咳 蛋白 純化 方法 | ||
1.一種純化百日咳菌毛蛋白的方法，所述方法包括以下步驟：
(1)百日咳菌經發酵培養后離心收集沉淀，尿素或其他適宜方法裂解菌體后得到PRN粗純液，經層析后收集流穿液；
(2)采用鹽析級聯疏水陰離子層析菌毛蛋白(Fim)粗純液；
(3)調節步驟(2)中收集的菌毛蛋白(Fim)粗純液pH和電導，過羥基磷灰石材料層析柱，洗脫收集得到Fim抗原；優選的，所述的羥基磷灰石材料層析柱為CHT層析柱；
上述步驟(1)～(3)都在2-8℃條件下進行操作。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，
步驟(2)所述的采用鹽析級聯疏水陰離子層析菌毛蛋白(Fim)粗純液的方法為：
方法一，鹽析級聯疏水陰離子層析：
1)在步驟(1)流穿液中加入重量體積比為10-30％的硫酸銨，攪拌1-2小時后，2-8℃靜置鹽析，離心，棄上清，收集鹽析沉淀；
2)用Tris-HCl緩沖溶液溶解步驟(2)中收集的沉淀，輕輕振蕩15-30分鐘，充分溶解沉淀，經離心后，棄掉沉淀，收集上清；
3)調節步驟(3)中收集的上清液pH和電導，過Capto Adhere疏水陰離子層析柱，收集流穿液得到菌毛蛋白(Fim)粗純液；
或方法二，疏水陰離子層析級聯鹽析：
1)調整步驟(1)流穿液pH和電導，過Capto Adhere疏水陰離子層析柱，收集流穿液；
2)加入重量體積比為10-30％的硫酸銨，攪拌1-2小時后，2-8℃靜置鹽析，離心，棄上清，收集鹽析沉淀；
3)用Tris-HCl緩沖溶液溶解收集的沉淀，輕輕振蕩15-30分鐘，充分溶解沉淀，離心收集上清，得到菌毛蛋白(Fim)粗純液。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，
所述的硫酸銨鹽析的時間是16-24小時；
所述的Tris濃度是5-50mM/L，pH8.0-9.0
所述的調節流穿液或上清液pH和電導為：調節pH為8.0-9.0，調節電導率10-50mS/cm。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述的調節步驟(2)中收集的菌毛蛋白(Fim)粗純液pH和電導為：調節pH為8.0-9.0，調節電導率＜10mS/cm。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述的洗脫收集中，洗脫液為pH8.0-9.0的含0.2-0.5M/L氯化鈉的PB緩沖液，直接洗脫收集目標峰。
6.權利要求1-5任一所述的方法在制備疫苗中的應用，優選的，所述的疫苗為百日咳疫苗。
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