[發(fā)明專(zhuān)利]烏龜輸卵管TLR2/4基因的鑒定引物及其方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011186125.X
• 申請(qǐng)日: 2020-10-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112342286A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-02-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 卜興江;蔡文龍;陳偉;王雅潔
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 安徽師范大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6879
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6879;C12Q1/6888;C12Q1/6851;C12N15/11;G01N33/68
• 代理公司: 北京風(fēng)雅頌專(zhuān)利代理有限公司 11403
• 代理人: 王冰冰

本發(fā)明提供了一種烏龜輸卵管TLR2/4基因的鑒定引物及其方法和應(yīng)用，其特征在于，鑒定引物包括用于對(duì)TLR2進(jìn)行PCR擴(kuò)增的第一引物對(duì)，序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；用于對(duì)TLR4進(jìn)行PCR擴(kuò)增的第二引物對(duì)，序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；用于對(duì)β?actin進(jìn)行PCR擴(kuò)增的第三引物對(duì)，序列如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示。本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)鑒定引物，運(yùn)用于基因的RT?qPCR實(shí)驗(yàn)，快速、穩(wěn)定擴(kuò)增烏龜輸卵管TLR2/4基因，觀察烏龜輸卵管TLR2/4基因的mRNA水平的變化，從而直接判斷雌龜是否交配過(guò)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種烏龜輸卵管TLR2/4基因的鑒定引物及其方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

烏龜(Mauremys reevesii)隸屬于于爬行綱(Reptilia)、龜鱉目(Testudinata)、地龜科(Geoemydidae)、擬水龜屬(Mauremys)。在野外環(huán)境中，烏龜因?yàn)榉N群密度低、移動(dòng)速度緩慢、雌龜與雄龜生殖周期分離等原因而帶來(lái)繁衍困難問(wèn)題。為延續(xù)物種，雄龜與雌龜交配完成后，精子會(huì)被儲(chǔ)存在雌性的輸卵管內(nèi)等待受精。而輸卵管內(nèi)的先天免疫系統(tǒng)能夠在防止?jié)撛诘牟≡w的侵襲方面發(fā)揮巨大的作用，但對(duì)于儲(chǔ)存在輸卵管內(nèi)的精子，先天免疫系統(tǒng)則被抑制，以便精子能夠長(zhǎng)期被儲(chǔ)存在輸卵管內(nèi)。

目前，在烏龜人工育種時(shí)需要用未交配過(guò)的雌龜作為母本，但大部分烏龜都是處于混養(yǎng)狀態(tài)，很難辨別烏龜是否交配過(guò)。因此，研究雌性烏龜輸卵管Toll樣受體水平的變化，可以用于鑒定烏龜?shù)慕慌淝闆r。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題。為此，本發(fā)明提供一種烏龜輸卵管TLR2/4基因的鑒定引物及其方法和應(yīng)用，目的是利用鑒定引物并投于RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，在節(jié)約成本的條件下，快速，準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增烏龜Toll樣受體基因片段，更直觀的觀察烏龜輸卵管TLR2/4基因的mRNA水平的變化，從而直接判斷雌龜是否交配過(guò)。

基于上述目的，本發(fā)明提供了一種烏龜輸卵管TLR2/4基因的鑒定引物，其特征在于，包括：

用于對(duì)TLR2進(jìn)行PCR擴(kuò)增的第一引物對(duì)，序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

用于對(duì)TLR4進(jìn)行PCR擴(kuò)增的第二引物對(duì)，序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；

用于對(duì)β-actin進(jìn)行PCR擴(kuò)增的第三引物對(duì)，序列如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示。

本發(fā)明還提供采用所述烏龜輸卵管TLR2/4基因的鑒定引物在檢測(cè)烏龜是否交配中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，通過(guò)免疫組織化學(xué)法對(duì)TLR2/4蛋白進(jìn)行檢測(cè)以輔助確定烏龜是否交配。

優(yōu)選的，所述免疫組織化學(xué)法是將烏龜輸卵管組織固定后，依次進(jìn)行脫水、包埋，切片、烤片、脫蠟及復(fù)水、抗原修復(fù)、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色、封片鏡檢。

本發(fā)明還提供一種擴(kuò)增烏龜輸卵管TLR2/4基因的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)提取待測(cè)樣品的總RNA；

(2)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成總cDNA；

(3)采用RT-qPCR引物對(duì)步驟(2)中總cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(4)取步驟(3)中得到的擴(kuò)增產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；

(5)采用RT-qPCR引物對(duì)步驟(2)中總cDNA進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增；

(6)對(duì)RT-qPCR擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn)行分析；

其中，所述RT-qPCR引物為烏龜輸卵管TLR2/4基因的鑒定引物。