[發明專利]烏龜輸卵管TLR2/4基因的鑒定引物及其方法和應用

在審

• 申請號: 202011186125.X
• 申請日: 2020-10-30
• 公開（公告）號: CN112342286A
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 卜興江;蔡文龍;陳偉;王雅潔
• 申請（專利權）人: 安徽師范大學
• 主分類號: C12Q1/6879
• 分類號: C12Q1/6879;C12Q1/6888;C12Q1/6851;C12N15/11;G01N33/68
• 代理公司: 北京風雅頌專利代理有限公司 11403
• 代理人: 王冰冰

1.一種烏龜輸卵管TLR2/4基因的鑒定引物，其特征在于，包括：

用于對TLR2進行PCR擴增的第一引物對，序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

用于對TLR4進行PCR擴增的第二引物對，序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；

用于對β-actin進行PCR擴增的第三引物對，序列如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示。

2.采用權利要求1所述烏龜輸卵管TLR2/4基因的鑒定引物在檢測烏龜是否交配中的應用。

3.根據權利要求2所述烏龜輸卵管TLR2/4基因的鑒定引物在檢測烏龜是否交配中的應用，其特征在于，通過免疫組織化學法對TLR2/4蛋白進行檢測以輔助確定烏龜是否交配。

4.根據權利要求3所述烏龜輸卵管TLR2/4基因的鑒定引物在檢測烏龜是否交配中的應用，其特征在于，所述免疫組織化學法是將烏龜輸卵管組織固定后，依次進行脫水、包埋，切片、烤片、脫蠟及復水、抗原修復、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色、封片鏡檢。

5.一種擴增烏龜輸卵管TLR2/4基因的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

(1)提取待測樣品的總RNA；

(2)將總RNA反轉錄成總cDNA；

(3)采用RT-qPCR引物對步驟(2)中總cDNA進行PCR擴增；

(4)取步驟(3)中得到的擴增產物做瓊脂糖凝膠電泳檢測；

(5)采用RT-qPCR引物對步驟(2)中總cDNA進行RT-qPCR擴增；

(6)對RT-qPCR擴增的結果進行分析；

其中，所述RT-qPCR引物為烏龜輸卵管TLR2/4基因的鑒定引物。

6.根據權利要求5所述擴增烏龜輸卵管TLR2/4基因的方法，其特征在于，所述步驟(4)檢測的產物中條帶所含有的DNA片段的長度分別為200-250bp。

7.根據權利要求5所述擴增烏龜輸卵管TLR2/4基因的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，以12.5μL的PCR擴增體系為基準，每條引物的用量分別為1μL，模板的用量為1μL。

8.根據權利要求5所述擴增烏龜輸卵管TLR2/4基因的方法，其特征在于，所述步驟(5)中，以20μL的RT-qPCR擴增體系為基準，每條引物的用量分別為1μL，模板的用量為1μL。

9.根據權利要求5所述擴增烏龜輸卵管TLR2/4基因的方法，其特征在于，所述PCR擴增和RT-qPCR擴增過程的退火溫度為58℃，退火時間為20s。

10.根據權利要求5所述擴增烏龜輸卵管TLR2/4基因的方法，其特征在于，所述步驟(6)是采用Bio-Rad CFX Manager對RT-qPCR擴增的擴增曲線和溶解曲線進行分析。