[發明專利]一種利用層生鐮刀菌發酵轉化黃芪甲苷制備環黃芪醇的方法

在審

• 申請號: 202011184825.5
• 申請日: 2020-10-30
• 公開（公告）號: CN114438158A
• 公開（公告）日: 2022-05-06
• 發明（設計）人: 張鵬;潘弘哲;陳毅明
• 申請（專利權）人: 廈門北化生物產業研究院有限公司
• 主分類號: C12P33/20
• 分類號: C12P33/20;C12P33/06;C07J53/00;C12R1/77
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本發明涉及一種利用層生鐮刀菌(Fusarium proliferatum 0821 CGMCC No.16482)發酵轉化黃芪甲苷制備環黃芪醇的方法。本發明利用篩選出的Fusarium proliferatum，以黃芪甲苷為底物，通過發酵，制得環黃芪醇。本發明利用Fusarium proliferatum發酵技術轉化黃芪甲苷得到高純度的環黃芪醇，整個工藝過程在常溫、常壓下進行，所要求的設備條件低，適用于大批量生產，最終環黃芪醇的轉化率達到80％以上、純度高達95％以上。

技術領域

本發明屬于醫藥化工領域，具體涉及一種利用層生鐮刀菌發酵轉化黃芪甲苷制備環黃芪醇的方法。

背景技術

黃芪是中醫臨床治療最常用的藥物之一。黃芪中的有效成分包括黃酮類、皂苷類、多糖類及氨基酸類。黃芪甲苷是黃芪皂苷的代表性化合物，具有提高免疫力、清除自由基、降壓以及抗菌等多種功效。而環黃芪醇是黃芪皂苷的苷元，分子式為C30H5OO5、相對分子質量為490.71，是黃芪甲苷在腸道內代謝的主要產物，具有促進傷口愈合，促進神經細胞增殖，抗衰老等作用。而且研究發現，環黃芪醇能夠起到激活端粒酶的作用，有效抑制端粒的減少，從而增強機體免疫力，抗衰老。

環黃芪醇為黃芪皂苷的苷元，主要由黃芪甲苷水解得到，易溶于甲醇、乙酸乙酯等。目前水解黃芪甲苷制備環黃芪醇的生產工藝主要為化學法、酶法及微生物發酵法。

化學法是通過強氧化劑水解斷開黃芪甲苷C3位置的木糖苷鍵和C6位置的葡萄糖苷鍵為得到環黃芪醇。中國發明專利CN104817610A使用硫酸水解黃芪甲苷制備環黃芪醇，反應器為一種高壓反應釜，水解溫度為130℃。硫酸水解反應條件劇烈，導致黃芪甲苷的三元環破壞嚴重，產生大量副產物。

酶法是采用多種水解酶復合的形式水解黃芪甲苷制備環黃芪醇。中國發明專利CN105734109A使用β-葡萄糖苷酶、油柑酶、纖維素酶、蝸牛酶的復合酶組合，使用復合酶的缺點是酶的成本較大，不易大規模生產。

微生物發酵法是中國發明專利CN106011213A使用犁頭霉發酵水解黃芪甲苷制備環黃芪醇的方法。相較于本發明來說，該方法黃芪甲苷的轉化率較低。

發明內容

本發明是利用篩選出的菌種層生鐮刀菌(Fusarium proliferatum 0821)(CGMCCNo.16482中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心北京市朝陽區北辰西路1號院3號保藏日期：20180911)，選用合適的培養基并在適當的培養條件下發酵轉化黃芪甲苷制備環黃芪醇。本發明的目的在于采用微生物轉化的方法來克服現有化學法和酶法制備環黃芪醇技術中副產物多、成本高、污染環境等缺點，并且比現有的微生物發酵制備環黃芪醇的轉化率高。

為實現上述發明目的，所采用的技術方案是：

(1)種子培養

將保存的菌種Fusarium proliferatum接入100mL裝有麥芽汁培養基的錐形瓶中，在25-30℃、150-200r/min的條件下培養36-48h，獲得種子液。

(2)轉化培養

將步驟(1)培養的種子液按10％的接種量接入100mL裝有發酵培養基的錐形瓶中，在25-30℃、150-200r/min的條件下培養6天，獲得發酵液。

(3)分離純化

將步驟(2)所得的發酵液經水飽和正丁醇等體積萃取三次后真空濃縮蒸干得到萃取產品，進一步利用硅膠柱層析分離純化，最終通過乙醇重結晶將產品的純度提高到95％以上，得到環黃芪醇產品。

上述步驟(2)中的發酵培養基的組成為：黃芪粉2g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，黃芪甲苷底物0.2g/L。