[發明專利]油酸水合酶突變體及其在制備10-羥基硬脂酸中的應用

有效

• 申請號: 202011182795.4
• 申請日: 2020-10-29
• 公開（公告）號: CN112226428B
• 公開（公告）日: 2022-11-08
• 發明（設計）人: 潘江;孫啟帆;許建和;陳琦;錢小龍
• 申請（專利權）人: 華東理工大學;蘇州百福安酶技術有限公司
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12P7/6409
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

本發明涉及油酸水合酶突變體及其在制備10?羥基硬脂酸中的應用，公開了一種活性及穩定性顯著提高的油酸水合酶突變體，其編碼基因和氨基酸序列，含有該基因序列的重組表達載體和重組表達轉化體，重組油酸水合酶突變體催化劑，以及該油酸水合酶突變體或重組油酸水合酶突變體催化劑在催化油酸轉化制備10?羥基硬脂酸與10?羰基硬脂酸中的實際應用。與現有技術相比，本發明的油酸水合酶突變體具有顯著高的活性和穩定性，從而極大地減少了催化劑的用量，并且在10?羰基硬脂酸的酶法氧化制備過程中，使用廉價的雙氧水作為氧化劑，成本低，綠色環保，在10?羰基硬脂酸的生產中將具有很好的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種嗜氨副球菌(Paracoccusaminophilus)來源的油酸水合酶的突變體，其編碼基因，含有該基因序列的重組表達載體和重組表達轉化體；重組油酸水合酶突變體催化劑，還涉及油酸水合酶突變體或重組油酸水合酶突變體催化劑在制備10-羥基硬脂酸，以及與10-羥基硬脂酸脫氫酶級聯制備10-羰基硬脂酸中的應用。

背景技術

油酸作為一種重要的天然產物，是典型的可再生資源，價格低廉、來源豐富。隨著高純度油酸生產技術的研發成功及高油酸植物的推廣，我國油酸的生產量呈逐年增長趨勢。2015年我國高純油酸行業產量約為1.65萬噸(中國油酸行業發展研究報告)，同比增長22.2％，且隨著油酸市場的不斷擴大，其生產規模還在不斷擴大。

油酸是一種含有碳碳雙鍵的長鏈脂肪酸，通過對其官能團進行修飾，可以獲得10-羥基硬脂酸和10-羰基硬脂酸等產物。其中10-羥基硬脂酸和10-羰基硬脂酸可以作為精細化學品和藥物等合成的化學中間體，具有較高的工業應用價值。有報道稱，10-羥基硬脂酸具有有益的美容作用，可以用于治療或預防由健康皮膚的生理體內平衡的負面發展引起的任何癥狀，以及促進頭發生長和脫發保護，改善皮膚老年斑和明顯的毛孔。

2011年，Oh等使用野生型的硝化短營養單胞菌(Stenotrophomonasnitritireducens)整細胞，在無氧條件下催化油酸水合反應，底物濃度為30g·L^-1，濕細胞上載量為20g·L^-1時，反應4h可以完全轉化，而在有氧條件下4h僅可轉化63％(Biotechnol.Lett.,2011,33:993-997)。2019年，許建和等挖掘到來源于Paracoccusaminophilus的油酸水合酶(簡稱PaOH)，在油酸濃度為90g/L，凍干酶粉上載量為5kU/L時，反應4h轉化率高于95％；在此基礎上，使用羥基硬脂酸脫氫酶催化水合產物10-羥基硬脂酸脫氫反應生成10-羰基硬脂酸，耦聯乳酸脫氫酶催化丙酮酸氧化反應實現輔酶NAD⁺的循環再生，繼續反應2h，10-羰基硬脂酸的最終生成得率為95.8％(中國專利CN110004133A)。

目前油酸水合酶的活力相對較低，由于缺乏有效的高通量篩選方法，因此活性以及穩定性改造研究較少；油酸水合酶級聯羥基硬脂酸脫氫酶制備10-羰基硬脂酸的過程中，使用昂貴的丙酮酸做為輔酶循環再生的輔底物，輔酶循環成本較高，不利于其在工業上的利用。

發明內容

鑒于目前已報道的油酸水合酶活性低、穩定性差，催化反應時空產率低的缺陷，本發明建立了高效簡便的油酸水合酶高通量篩選方法，從嗜氨副球菌(Paracoccusaminophilus)來源的油酸水合酶PaOH出發，通過分子工程手段提高其活性和穩定性，得到催化性能更高的油酸水合酶突變體。在此基礎上，將油酸水合酶突變體用在制備10-羥基硬脂酸中，改善了10-羥基硬脂酸酶法轉化制備10-羰基硬脂酸的輔酶再生過程，有效降低了10-羰基硬脂酸的生產成本。

本發明總體目標是建立高效的高通量篩選方法，通過分子改造手段，提高油酸水合酶的活力及熱穩定性，并建立較為廉價適宜的輔酶循環體系，以降低生產成本。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：

本發明的技術方案之一，獲得催化性能明顯改善的油酸水合酶突變體。